Name: Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-23T17:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 5 s
Description: Keşfedin, insan vitreus gövdesinin diseksiyon tekniklerini ve alt yapılarının ayrıştırılmasını. Bu yöntem, oftalmoloji ve proteomik analizler için örnek hazırlamada araştırmacılara yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Finansman Fight for Sight tarafından sağlanan. Dokular Iowa Lions Göz Bankası elde edildi.

1. Ön Segment Diseksiyon. <ol><li> (Şekil 1) 15 ° bir bıçak kullanarak ön odasına limbus bir kesi yaparak kornea kaldırılır. Sonra bir bıçak, kavisli kornea-skleral makas, ön kamara eklenir. Dairesel keser limbus sadece ön kornea yapılır. </li><li> 0.12 Colibri forseps ve Westcott'a makas, iris, siliyer cisim dairesel ön kesmek için kullanılır. </li><li> Lens çekirdeği 0,12 Colibri forseps veya 15 ° bıçağı (supersharp) ve forseps ile korteks ve kapsül ile kaldırılır. </li></ol> 2. Vitreus Çekirdek Aspirasyon. <ol><li> 5 cc şırınga, 23-gauge iğne sokulur orta vitreus (Şekil 1). </li><li> Yaklaşık 1 ml veya daha fazla vitreus çekirdek nazikçe aspire edilir. </li><li> Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir. </li></ol> 3. Anterior Hyaloid Diseksiyon. <ol><li> Anterior hyaloid bir kaz boynu mikroskop ışık ışık ayarlayarak yarı saydam bir halkası olarak görülüyor. Önceki vitreus çekirdek aspirasyonu, diğer yapılardan daha kolay tespit edilebilmesi için ön hyaloid ayırır. </li><li> Colibri veya giyinme forseps ile siliyer cisim elastik doku sayfasını dikkatlice çekti ve Vannas makas ile kesilir. Bu manevra tekrarlanır. </li><li> Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir. </li></ol> 4. Vitreus Base Diseksiyon. <ol><li> Göz fincan stabilize 0.12 forseps kullanma, Westcott makas, siliyer cisim, optik sinir başı doğru dört eşit aralıklı stres giderici kesikler yaparak "çiçek" göz için kullanılır. </li><li> Siliyer cisim (Şekil 2) pars Plicata Westcott makas kullanarak kadranın her kaldırılır. </li><li> Vitreus tabanı, pars plana ve retina (Şekil 2) üzerinde forseps ile ora serrata her iki tarafta kavradı. </li><li> Vitreus tabanı sürekli çekiş forseps uygulanır. Eksize olarak Sıralı Westcott makas ile kesme "inci string" görünümü ile yarı saydam bir doku ayıklar. </li><li> Örnek sonra, bir mikrofuge'de tüp içinde ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir. </li></ol> 5. Vitreus Cortex Kaldırma. <ol><li> Pars plana ora serrata (Şekil 2) posterior yaklaşık 3 mm broşürün keserek Westcott makas ile kadranın her eksize edilir. </li><li> Vitreus korteks doku broşürler arasında, yarı saydam bir film olarak görüntülenmiştir. </li><li> Elastik film ya 0.12 forseps ile kavradı veya Weck-Cel cerrahi sünger bağlılık tarafından düzenlenen. Vitreus korteksi sonra retinanın uzak çekti ve Westcott makas (Şekil 1) ile birlikte çıkarıldı. </li><li> Örnek bir mikrofuge'de tüp ve daha sonra sıvı azot içine yerleştirilir. Tüm numuneler deney için kullanılan -80 ° C kadar saklanır. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar Doku örnekleri özel deneyler için çok çeşitli yöntemler tarafından işlenebilir. Bizim durumumuzda, örnekler, SDS-PAGE (Şekil 3) protein analizi için sunulmuştur. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Insan gözünün kesitsel görünümü vitreus vücudun farklı altyapılardan resmeden en ön vitreus ön hyaloid denilen ince bir kollajen tabakası. Vitreus çekirdek vitreus vücudun tüm merkez bölgesi oluşur. Vitreus bu bölümü yeterli viskoz forseps ile kavranabilir ve yatan siliyer cisim ve retina sıkıca bağlı olan vitreus tabanı, aksine daha sulu. Vitreus çekirdek yakınınızda vitreus korteks denilen çok ince bir kollajen kabuk. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Vitreus tabanı anatomisi. Vitreus tabanı, siliyer cisim ve retina ayıran hat, ora serrata (beyaz oklar), yanında bulunan vitreus yarı saydam bir altyapı . Vitreus tabanının ön sınır siliyer cisim pars plana (beyaz çizgi) boyunca uzanır. Vitreus tabanının arka sınır ora serrata (beyaz çizgi) posterior 2-3 mm uzanır. Tüketim için vitreus tabanı, forseps doku kavramak ve altta yatan siliyer cisim ve retina uzağa çekmek için kullanılır. Yükselmiş, sonra Westcott makas tabanı boyunca kesmek için kullanılır. <img src="/files/ftp_upload/2455/2455fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Tek boyutlu Vitreus Gövde Elemanları SDS-PAGE ön hyaloid total protein konsantrasyonları, vitreus tabanı, vitreous çekirdek, ve vitreus korteksi sırasıyla 11.24, 20.1, 16.61, 14.24 mg / ml idi. Jel elektroforezi 45 dakika için 200 kV Flamingo (Bio-Rad) ile boyanmış ve bir VersaDoc Görüntüleme sistemi (Bio-Rad) kullanılarak görüntülendi. Farklı dokular için profilleri, farklı yerelleştirilmiş proteinler gösteren korunmuş (yıldız) veya protein çapraz kirlenmesine neden olan, aynı zamanda benzersiz bantları gösteren, benzer pek çok bantları göstermektedir.

<ol><li>Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+macromolecules+and+supramolecular+organisation+of+the+vitreous+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Structural macromolecules and supramolecular organisation of the vitreous gel.</a> Prog Retin Eye Res. 19, 323-344 (2000).</li>
<li>Sebag, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+biology+of+pharmacologic+vitreolysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trans+Am+Ophthalmol+Soc%22%5BJournal%5D)">Molecular biology of pharmacologic vitreolysis.</a> Trans Am Ophthalmol Soc. 103, 473-494 (2005).</li>
<li>Yoshimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+analysis+of+inflammatory+immune+mediators+in+vitreoretinal+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Comprehensive analysis of inflammatory immune mediators in vitreoretinal diseases.</a> PLoS One. 4, e8158-e8158 (2009).</li>
<li>Gao, B. B., Chen, X., Timothy, N., Aiello, L. P., Feener, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+vitreous+proteome+in+diabetes+without+diabetic+retinopathy+and+diabetes+with+proliferative+diabetic+retinopathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of the vitreous proteome in diabetes without diabetic retinopathy and diabetes with proliferative diabetic retinopathy.</a> J Proteome Res. 7, 2516-2525 (2008).</li>
<li>Izuta, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+SOD+and+VEGF+are+increased+in+vitreous+bodies+from+proliferative+diabetic+retinopathy+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Extracellular SOD and VEGF are increased in vitreous bodies from proliferative diabetic retinopathy patients.</a> Mol Vis. 15, 2663-2672 (2009).</li>
<li>Azimzadeh, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formalin-fixed+paraffin-embedded+%28FFPE%29+proteome+analysis+using+gel-free+and+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) proteome analysis using gel-free and gel-based proteomics.</a> J Proteome Res. 9, 4710-4720 (2010).</li>
</ol>

Vitreus tabanı, çekirdek, korteks, anterior hyaloid: vitreus moleküler bileşimini özellikle altyapılardan düzeyinde yeterince anlaşılır bir yarı saydam bir jel. Vitreus çekirdek diyabetik retinopati gibi hastalıklar ile ilişkili olduğu, kondroitin sülfat proteoglikanlar, heparan sülfat proteoglikanların, ve vitreus çekirdek hyaluronan 1,2 Protein biyobelirteçleri ile birlikte kolajenlerin II, V, IX, ve XI içerir. 3-5 nasıl Bu proteinlerin farklı altyapılardan, her ifade ve özel protein kimlikler, birçok durumda bilinmemektedir. Bu ayrıntıları belirli Vitreoretinal hastalıklar ile ilişkili proteinlerin kökenini fikir vermek ve hedef gelecekte tedaviler yardımcı olabilir. Doku diseksiyonu için optimum post mortem aralığı tespit edilmemiş olmasına rağmen, protein bozulması downstream deneyler etkileyebilir. Örneğin, 12 saatlik postmortem gözünde immünohistokimya etkilenir ve bazı özel enzim aktiviteleri (basılmamış gözlem), birkaç saat içinde azalabilir. Bu çalışmada tüm dokuların protein ekspresyonu veya proteomik analsyis uygunluğu önemli değişiklikler olmadan ölüm 2 ve 8 saat arasında toplanmıştır. Korunması sıvı nitrojen dondurma yöntemi fiksatif çapraz bağlama, diğer dokularda LC-MS/MS tarafından kanıtlanmıştır neden protein yapısındaki küçük değişiklikler önlemek için fiksasyon üzerinde seçilen 6 Proteomik çalışmalar doğru bir şekilde yeteneğine bağlıdır Bu video deneyde ortaya vitreus farklı bölmeleri, teşrih. SDS-PAGE 1-boyutlu diseksiyon tekniği kullanılarak valide var. Sonuçlar, farklı çeşitli vitreus altyapılar proteinlerin ifade edilir. Bu proteinlerin belirlenmesi vitreus bölümlendirme daha ayrıntılı bir anlayış sağlayacak.

<table border="1"><tbody><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> 0.12 forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E1502 </td></tr><tr><td> 5-cc şırınga </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 309603 </td></tr><tr><td> Çentikler ile Düz Giyinme Forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E1400 </td></tr><tr><td> 23 iğne </td><td> Becton-Dickinson </td><td> 305145 </td></tr><tr><td> Colibri forseps </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> 2 / 132 </td></tr><tr><td> Castroviejo açılı kornea makası </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E3223 </td></tr><tr><td> Vannas Kavisli kapsülotomi Makas </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E3387 </td></tr><tr><td> Weck-Cel cerrahi spears </td><td> Medtronic </td><td> 0008680 </td></tr><tr><td> Westcott Kavisli tenotomisi Makas </td><td> Storz Ophtalmics&#39;in </td><td> E3320 </td></tr></tbody></table>

proteomik analizi İnsan vitreus gövde elemanları diseksiyonu

Dissection of Human Vitreous Body Elements for Proteomic Analysis

Vitreus, göz ve retina üzerinde yer içini doldurur optik açık bir kollajenöz ekstrasellüler matriks, vitreus altyapılar ve retina arasında 1,2 Anormal etkileşimleri retina yırtığı ve dekolmanı, maküler pucker, makula deliği dahil olmak üzere birçok vitreoretinal hastalıkların , altında yaşa bağlı makula dejenerasyonu, vitreomaküler çekiş, proliferatif vitreoretinopati, proliferatif diyabetik retinopati ve miras Vitreoretinopatilerde. 1,2 vitreus altyapılardan moleküler kompozisyonu bilinmemektedir. Vitreus sınırlı cerrahi erişim ile şeffaf olduğundan, moleküler düzeyde altyapılar incelemek için zor olmuştur. Proteomik ve biyokimyasal analiz için ayrı ve bu dokuları korumak için bir yöntem geliştirdi. Bu deneysel video diseksiyon tekniği, vitreus tabanı, anterior hyaloid, vitreus çekirdek ve postmortem insan gözü vitreus korteks izole etmek için nasıl gösterir. Her vitreus bileşeni tek boyutlu SDS-PAGE analizleri bizim diseksiyon tekniği, insan vitreus vücudunun her bir altyapı karşılık gelen dört benzersiz protein profilleri yol açtığını gösterdi. Farklı bölümlere proteinlerin belirlenmesi, aday molekülleri çeşitli vitreoretinal hastalıkların altında yatan ortaya koyacaktır.

Bu video post-mortem gözünde, insan vitreus vücudunun çeşitli yarı saydam yapıların ayrılması ve diseksiyon için etkili bir teknik gösterir.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

Vitreus, gözün içini dolduran ve retinanın üzerinde yer alan, optik olarak şeffaf, kolajen yapılı bir hücre dışı matristir. 1,2 Anormal etkileşimler...

Vitreus, gözün içini dolduran, optik olarak şeffaf bir hücre dışı matristir. Lensin arkasındaki anterior hyaloid, anterior retinadaki vitreus tabanı, elastik bir kabuk oluşturan vitreus korteksi ve merkezdeki vitreus çekirdeği dahil olmak üzere birkaç alt yapıya ayrılabilir. Vitreusu diseke etmek için öncelikle anterior segmenti çıkarmamız gerekir.Limbus bölgesinde korneayı insize etmek için çok keskin bir bıçak kullanılır. Ardından, korneayı limbusun hemen önünden kesmek için kornea skleral makaslar kullanılır. İris, yüzeyinden çekilerek kavisli makaslarla diseke edilir.Küreye uygulanan hafif basınç çekirdeği dışarı itebilir. Vitreöz çekirdeği çıkarmak için, beş cc'lik bir şırınga üzerinde 23 gauge iğne kullanın ve çoğunlukla sıvı haldeki vitreözü aspire edin. Anterior hyaloid, forsepsle tutulabilen ince, şeffaf bir membran yapısı olarak görünür hale gelir.Lensin hemen arkasında bulunan elastik bir yapıdır. İç çember Zonül ligamanıdır. Pensle traksiyon uygulanırken, hiyaloidi kesmek için Van makası kullanılır.Lat dokusu bir afu tüpüne aktarılabilir ve tüm doku diseke edilene kadar işlem tekrarlanır. Geriye kalan vitreus alt yapılarına erişmek için gözün kavisli westcott makası kullanılarak açılması gerekir. Her bir flep, bir Petri kabı içerisinde pensle kenara çekilir.Bu görüntü, ora serrata'yı çevreleyen ince, şeffaf bir doku olan vitreöz bazın anatomisini göstermektedir. Ora serrata, ön tarafta siliyer cisim ile arka tarafta retina arasındaki ayırıcı çizgidir. Vitreözün diğer bölümlerinin aksine, vitreöz baz altındaki siliyer cisim ve retinaya sıkıca yapışıktır; forsepsle çekmek dokuyu gerçekten yükseltecektir.Vitreöz tabanı izole etmek için öncelikle pars platayı forseps ve Westcott makası kullanarak çıkarırız. Pars plata, üzerindeki kıvrımlarla görülen bu küçük alandır. Ardından vitreöz tabanını izole etmek için, gözü forseps ile stabilize ederken Westcott makası ile oranın iki ila üç milimetre posteriorundan kesin; vitreöz tabanını forseps ile tutarak traksiyon uygulayın ve Westcott makası ile ardışık olarak kesin.Vitreöz tabanı eksize edildiğinde inci dizisi görünümü oluşur ve bu ekstraselüler matrisin proteinleri nasıl bölmelere ayırabildiği gözlemlenebilir. Vitreöz kabuğunu diseke etmek için farklı teknikler kullanılabilir. WEX hücre süngeri ile temas, korteksi yükseltecektir.Burada gösterildiği gibi, yaprakçıklar arasında bir korteks kenarı bulunabilir. Yine, traksiyon oluşturmak için forseps kullanın ve vitreöz korteksi ardışık olarak kesmek için VanNess makası kullanın. Korteks ayrıca diskten yukarı kaldırılabilir ve burada, korteks retina yüzeyinden dikkatlice soyulurken onu diseke etmek için daha büyük Westcott makasları kullanılır.Numuneler daha sonra bir mikrotüpe yerleştirilebilir ve ileride yapılacak proteomik analizler için saklanabilir.

dissection-of-human-vitreous-body-elements-for-proteomic-analysis

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Insan dışı primat gelişimi ve yaşlanma anlamak için önemli bir translasyonel türüdür. Primat retinanın anatomik organizasyonu, insanlarda normal ve patolojik durumları önemli bilgiler verebilir.

Beyin Ağ Geçidi: Primate Göz Diseksiyon

Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

8 gün yaşlı bir fare Sinir retina% 4 jelatin bloğunun üstünde olduğunu. Vibratome ile fotoreseptör tabakası (200 um), izole edildikten sonra, fotoreseptör kültür mekanik ve enzimatik ayrışma sonrasında tohumlanır. fotoreseptör moleküler ve biyokimyasal analizler ya da transplantasyon için kullanılabilir.

Vibratome Kesit Fare Retina fotoreseptör Kültürler hazırlayın

Bu protokolün amacı, post mortem enükleasyonlu domuz gözlerinden bütün, sağlam vitreus çekirdeği ve korteksi izole etmek için etkili bir teknik göstermektir.

Vitreodynamic Analiz Tüm Vitreus Mizah Diseksiyon

İnsan retina fovea, makula ve periferik retina gibi işlevsel ve tatlı farklı bölgelerinde oluşur. Burada, incelemek ve bu farklı retina bölgeler aşağı akım proteomik analiz için toplamak için punch biyopsi ve doku katmanları bir insan gözünün üzerinden el ile kaldırılması kullanarak bir yöntemi açıklanmaktadır.

İnsan Retina ve RPE koroid diseksiyon proteomik analizi için

Proteom karakterizasyonu oküler mikrovasküler yatak birçok oküler patolojiler insanlarda derinlemesine anlayış için çok önemli. Bu çalışmada protein çıkarma ve küçük kan damarlarının kütle spektrometresi esaslı proteomik analizleri kapları modeli olarak domuz kısa arka silier arterler istihdam üzerinden numune hazırlama için etkili, hızlı ve güçlü bir yöntem gösterir.

Oküler yüzdeki kütle spektrometresi esaslı proteomik analiz için numune hazırlama

İnsan gözünde retinal pigment epitelini (RPE) retinadan etkin bir şekilde ayırmak ve RPE'nin histolojik ve morfometrik analizleri için tüm RPE / koroid düzlüklerini üretmek için bir yöntem tanımladık.

Histolojik Analiz için İnsan Gözünden Retinal Pigment Epitel/Koroid Flatmount'larının Verimli ve Tutarlı Üretimi

Bu protokol, proteomik, metabolomik ve glikomikler dahil olmak üzere moleküler aşağı akış analizleri için yüksek kaliteli insan sulu mizah ve vitreus sıvı biyopsilerinin standartlaştırılmış toplanması, ek açıklama ve biyobankacılığı için entegre bir biyodepo platformu sunmaktadır.

Moleküler Analizler için İnsan Sulu ve Vitröz Sıvı Biyopsilerinin Biyobankacılığı

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Bu yöntem, konfokal yansıma mikroskobu kullanarak vitreus gövdesindeki kollajen liflerinin doğal yapısını görselleştirir.

Vitreus kollajen lif ağını görselleştirmek için domuz gözlerinin konfokal yansıma mikroskobuna hazırlanması

Keşfedin, insan vitreus gövdesinin diseksiyon tekniklerini ve alt yapılarının ayrıştırılmasını. Bu yöntem, oftalmoloji ve proteomik analizler için örnek hazırlamada araştırmacılara yardımcı olur.

Proteomik Analizi İnsan Vitreus Gövde Elemanları diseksiyonu

Daha fazla video keşfet