JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:22 dk. • August 31st, 2026
Besin açısından zengin bir ortamda insan embriyonik böbrek hücreleri içeren bir kültür flaskı ile başlayın.
Plazmidlerin hücrelere iletimini artırmak için besiyerini, klorokin içeren taze besiyeri ile değiştirin.
İnfluenza yüzey proteinlerini, lentiviral çekirdek proteinlerini ve lentiviral genomu kodlayan plazmitlerin karışımını kalsiyum fosfat ile birlikte alın. Kalsiyum fosfat–DNA kompleksleri oluşturmak için inkübe edin.
Karışımı hücrelere ekleyin ve nazikçe karıştırın. Kompleksin endositoz yoluyla hücrelere girmesine izin vermek için inkübe edin. Klorokin, plazmit DNA'nın endozomal kaçışını kolaylaştırır.
Hücre içerisinde, plazmit DNA hem influenza hem de lentiviral bileşenlerin ekspresyonunu yönlendirir.
Fazla kompleksleri uzaklaştırmak için medyumu değiştirin.
Viral bileşenlerin birleşmesine ve kültür ortamına salınan psödovirüsler olarak tomurcuklanmasına izin vermek için inkübe edin.
Pseudovirüsleri içeren medyumu toplayın ve hücresel kalıntıları çöktürmek için santrifüjleyin.
Psödovirüs içeren süpernatanı toplayın ve sonraki analizler için düşük sıcaklıklarda saklayın.
Başlamak için, tam DMEM ortamında HEK 293FT hücrelerinden tek hücre süspansiyonu hazırlayın. T75 flaska on mililitre tek hücre süspansiyonu ekleyin ve ardından otuz yedi santigrat derecede inkübasyona bırakın.
Transfeksiyondan iki saat önce, eski besiyerini klorokin içeren on mililitre taze tam besiyeri ile değiştirin. Reaktifleri ve plazmid DNA'yı makalede açıklandığı şekilde karıştırın. Ardından bu karışımı hücrelerin üzerindeki besiyerine aktarın ve yavaşça sallayın.
İnkübasyon sonrası, besiyerini 15 mL taze complete DMEM besiyeri ile değiştirin. Altmış beş saat sonra, santrifüjleme yoluyla süpernatantı toplayın. Süpernatantı toplayıp alikotlara ayırın.