Adeno-ilişkili Virüsün Retinal Geçirgenliğinin Değerlendirilmesi için Fare Retinal Kriyokesitlerinin Hazırlanması

Yeşil floresan protein geni taşıyan adeno-ilişkili virüs ile önceden enjekte edilmiş, retinal bariyeri bozulmuş bir fare modelinden alınan bir göz kullanın.

Bozulmuş retinal bariyer, AAV'nin fotoreseptör hücrelere nüfuz etmesine izin verir; burada viral genom, GFP üretmek için eksprese edilerek hücrelerin floresan özellik kazanmasını sağlar.

Gözü, kornea ve lensi çıkaracak şekilde diseke edin ve göz çukuru (eyecup) yapısını sağlam bırakın.

Retina yapısını korumak için göz çukurunu bir fissiklatif çözeltiye daldırın.

Göz çukurunu, artan konsantrasyonlardaki kriyoprotektan çözeltiler aracılığıyla sırayla aktarın. Daha sonra, buz kristali oluşumunu önlemek için son konsantrasyonda inkübe edin.

Göz çukurunu kriyojenik ortama gömün ve dondurun.

Bir kriyostat kullanarak, göz çukurunu ince dilimler halinde kesin.

Kesiti bir lam üzerine monte edin. Sonraki immün boyama sırasında antikorların erişimini sağlamak amacıyla dokuyu permeabilize etmek için deterjan içeren bir tampon ekleyin.

Kesiti durulayın. İmmün boyama sırasında spesifik olmayan antikor etkileşimlerini önlemek için bir bloklama çözeltisi ile işlem uygulayın.

Retinal kriyokesit, daha ileri immünboyama prosedürleri ve floresan görüntülem