JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:54 dk. • August 31st, 2026
Yeşil floresan protein geni taşıyan adeno-ilişkili virüs ile önceden enjekte edilmiş, retinal bariyeri bozulmuş bir fare modelinden alınan bir göz kullanın.
Bozulmuş retinal bariyer, AAV'nin fotoreseptör hücrelere nüfuz etmesine izin verir; burada viral genom, GFP üretmek için eksprese edilerek hücrelerin floresan özellik kazanmasını sağlar.
Gözü, kornea ve lensi çıkaracak şekilde diseke edin ve göz çukuru (eyecup) yapısını sağlam bırakın.
Retina yapısını korumak için göz çukurunu bir fissiklatif çözeltiye daldırın.
Göz çukurunu, artan konsantrasyonlardaki kriyoprotektan çözeltiler aracılığıyla sırayla aktarın. Daha sonra, buz kristali oluşumunu önlemek için son konsantrasyonda inkübe edin.
Göz çukurunu kriyojenik ortama gömün ve dondurun.
Bir kriyostat kullanarak, göz çukurunu ince dilimler halinde kesin.
Kesiti bir lam üzerine monte edin. Sonraki immün boyama sırasında antikorların erişimini sağlamak amacıyla dokuyu permeabilize etmek için deterjan içeren bir tampon ekleyin.
Kesiti durulayın. İmmün boyama sırasında spesifik olmayan antikor etkileşimlerini önlemek için bir bloklama çözeltisi ile işlem uygulayın.
Retinal kriyokesit, daha ileri immünboyama prosedürleri ve floresan görüntüleme için hazırdır. GFP-pozitif floresan hücreler, başarılı viral transduksiyonu ortaya koyarak retinal geçirgenliği göstermektedir.
Ötanize edilmiş enjekte hayvandan gözler alındıktan sonra, lens ve korneayı çıkarmak için gözleri disseke edin. Ardından, disseke edilen gözü 4% paraformaldehitte bir saat boyunca daldırma sabitlemeye tabi tutun. Bir saat sonra, gözleri oda sıcaklığında bir saat daha %10 sakkarozda kriyoprotekte edin. Daha sonra gözleri oda sıcaklığında yirmi dakika boyunca %20 sakkarozda bekletin.
Son olarak, gözleri gece boyunca 4 °C'de %30'luk sakkaroz çözeltisinde bekletin. Ertesi gün, göz çukurlarını Cryo-matrix gibi bir gömme rezinine gömüp dondurun. Ardından, kriyostat kullanarak 10 µm kalınlığında kesitler alın ve bunları donmuş dokular için hazırlanmış lamlara monte edin.
Şimdi, lamlar üzerindeki kesitleri deterjan ile beş dakika boyunca permeabilize edin. Bunu, PBS ile yapılan iki kısa yıkama ile takip edin. Ardından gözleri oda sıcaklığında bir saat boyunca bloke edin.