JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:24 dk • August 31st, 2026
İşleme, daha önce floresan bir protein kodlayan ilgi alanı geni taşıyan bir adeno-ilişkili virüs (AAV) enjekte edilmiş transgenik bir farenin gözü ile başlayın.
Fare, retinayı vitreus boşluğundan ayıran bir bariyer olan inner limiting membrane (ILM) bütünlüğünün korunması için gerekli olan bir genden yoksundur.
Bu genin kaybı retinal dejenerasyonu taklit ederek virüsün retinal hücre katmanlarının daha derinlerine nüfuz etmesini sağlar.
Enfekte retina hücreleri, ilgili geni eksprese ederek floresan proteinler üretir ve böylece floresan yaymalarını sağlar.
Şimdi, gözü diseke edin ve kornea ile lensi çıkarın.
Retinayı, retinal pigment epitelyumundan (RPE) ve gözün dış tabakası olan skleradan dikkatlice ayırın.
Dokuyu fiksatif içerisine daldırın.
Kalıntı fiksatifleri uzaklaştırmak için fosfat tamponu ile yıkayın.
Konfokal mikroskop altında gözlemlendiğinde, retinal hücrelerdeki floresans, hasarlı iç sınırlayıcı membran üzerinden başarılı viral penetrasyonu göstermektedir.
Retinal flat mountlar için, diseksiyonu kolaylaştırmak amacıyla enükle edilen gözleri 15 ila 30 dakika boyunca %4 paraformaldehitte sabitleyin. GFP floresansının korunması için bu sabitleme ve diseksiyon sonrası yapılan sabitleme işlemi düzgün bir şekilde gerçekleştirilmelidir. 15 ila 30 dakikalık sabitleme süresi içinde gözleri diseke edin, korneayı ve lensi çıkarın.
Ora serrata ve optik sinir çevresinden keserek retinayı, retinal pigment epitelyumundan ve sklera'dan ayırın. Diseksiyonun ardından, dokuyu ve transdükte retinal hücrelerdeki floresan proteini sabitlemek için retinaları 30 dakika daha %4 paraformaldehit içinde bekletin. Sabitleme işleminden sonra, örneği pH 7.4 steril PBS ile beş dakika boyunca yıkayın.