JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:24 dk • August 31st, 2026
Genetik materyal içermeyen virüs benzeri partiküller olan viral kapsidleri içeren tüpleri alın.
Tüpleri sabit bir sıcaklıkta farklı süreler boyunca ısıtın.
Daha kısa bir ısıtma süresi kapsid proteinlerini hafifçe strese sokarken, uzatılmış ısıtma kapsidi bozar ve agregasyona neden olur.
Daha fazla yapısal değişikliği önlemek için tüpleri hızla soğutun.
Sıvıyı bir parafin film üzerine aktarın.
Bir transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) ızgarasını damlanın üzerine yerleştirin. Kapsidlerin ızgara yüzeyine tutunmasını sağlayın.
Fazla sıvıyı uzaklaştırmak için ızgarayı bir filtre kağıdıyla emdirin.
Gevşek şekilde tutunmuş kapsidleri uzaklaştırmak için bir tamponla yıkayın, ardından ızgarayı tekrar kurulayın.
Kapsid yüzeyine bağlanan ve onların TEM altında daha koyu görünmesini sağlayan bir ağır metal boyası olan uranil asetat içine daldırın.
Izgarayı kurutun ve bir plakaya yerleştirin. Nemi gidermek için plakayı bir desikatörde saklayın.
Isı kaynaklı kapsid hasarını görselleştirmek için ızgarayı TEM kullanarak görüntüleyin.
10 millimolar HEPES, pH 7,4 yerine PBS kullanarak ve işlemden sonra kapsidleri daha fazla seyreltmeyerek daha önce olduğu gibi ısıtma işlemini gerçekleştirin. Ardından, işlem görmüş kapsid çözeltisinin tüm 15 microliter damlasını parafin film üzerine pipetleyin. Izgara kenarını, ızgarayı tutmak için kenarda kapanmalarına izin vererek cımbızla kavrayın ve ızgarayı, karbon tarafı aşağı gelecek şekilde işlem görmüş çözelti damlasının üzerine yerleştirin.
Kapsidin ızgaraya tutunmasını sağlamak için ızgarayı 10 dakika boyunca inkübe edin. Kapsid preparasyonunun saflığına bağlı olarak, işlem görmüş kapsid damlacığının ardına sıralı şekilde yerleştirilmiş 10 ila 15 µL'lik damlacıklar halinde HEPES çözeltisi ile yıkamalar ekleyin. 10 dakika sonra, ızgarayı damlacıkla birlikte kaldırın.
Damlacığı emdirmek için ızgarayı bir filtre kağıdı parçasına neredeyse dik olarak yerleştirin. Ardından, 10 ila 15 µL HEPES tamponu damlacığını almak için ızgarayı kullanın ve 30 saniye boyunca bekletin. 30 saniyelik yıkama süresinden sonra, başka bir filtre kağıdı parçasıyla emdirerek temizleyin.
Ardından, boş bir alandaki parafin film üzerine %2'lik urasil asetat çözeltisinden 15 µL'lik bir damla yerleştirin. Urasil asetat damlasını ızgara ile alın ve 45 saniye boyunca bekletin. Daha sonra, çözeltinin büyük bir kısmını uzaklaştırdığınızdan emin olarak urasil asetatı filtre kağıdıyla çekin.
Izgaranın cımbızdaki neme yapışmamasına dikkat ederek, karbon tarafı yukarı gelecek şekilde bir filtre kağıdı parçası üzerine yerleştirin. Ardından, üzerinde ızgara bulunan filtre kağıdını açık bir cam Petri kabına koyun. Bu işlemi tüm işlemler için tekrarladıktan sonra, ızgaraların bulunduğu Petri kabı yarımlarını TEM ile gözlemlemeden önce kurumaları için gece boyunca bir desikatörde bekletin.