JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:28 dk • August 31st, 2026
Genetik olarak modifiye edilmiş spiroket bakteri kültürünü alın. Bu bakteriler gentamicin direnç genini taşımaktadır.
Bakteriyel kültüre bir bakteriyofaj süspansiyonu ekleyin.
Fajlar, kanamisin direnç geni kodlayan plazmid DNA'sı taşımaktadır.
Karışımı inkübe edin.
Bakteriyofaj, bakteriyel yüzeye tutunur ve DNA'yı hücre içine enjekte eder.
Plazmid bağımsız olarak replike olur ve bakteriler bölündüğünde aktarılır.
İnkübe edilmiş kültürü, gentamisin ve kanamisin antibiyotikleri ile desteklenmiş erimiş agaroz ortamı ile karıştırın.
Karışımı bir plakaya dökün. Katılaşmasını bekleyin ve ardından inkübe edin.
Çift antibiyotik seçimi altında, yalnızca her iki direnç belirtecini de taşıyan hücreler büyüyüp koloni oluştururken, geri kalan hücreler ölür.
Bir koloni seçin ve her iki antibiyotiği de içeren bir besiyerine inoküle edin.
Daha sonraki analizler için, transduce edilmiş plazmide sahip bakterilerin büyümesini kolaylaştırmak amacıyla inkübe edin.
Süpernatantı dökün ve pelletleri 14,5 mililitre taze BSK içinde yeniden süspande edin. Alıcı klon kültürüne 50 mikrolitre veya daha az miktarda PEG ile çöktürülmüş faj örneği ekleyin.
İyice karıştırdıktan sonra, 3 °C'de 72 ila 96 saat boyunca inkübe edin. PEG ile çöktürülmüş faj ile karıştırdıktan sonra, makalede açıklandığı gibi katı faz plaka ekimi ile transdükta seçilimini gerçekleştirin. Alıcı klonun arka planına bağlı olarak, 10 ila 21 günlük inkübasyonun ardından seçilim plakalarındaki agaroz içerisinde kolonilerin oluşup oluşmadığını kontrol edin.
Her iki antibiyotiğin bulunduğu plak üzerinde büyüyen en az 5 ila 10 koloni, sterilize edilmiş pamuk tıkalı 5.75-inches borosilikat pipet kullanılarak seçilmeli ve uygun antibiyotik içeren 1.5 milliliters BSK içerisine inoküle edilmelidir.