JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:30 dk. • August 31st, 2026
Lentiviral transdüksiyonu kolaylaştırmak için kısmen disosiye edilmiş fare intestinal organoidleri ile başlayın.
Transdüksiyon ortamındaki lentiviral vektörleri alın.
Lentivirüs, konak genomuna stabil entegrasyon için ilgilenilen bir geni taşır.
Lentivirüsü kuyucuğa ekleyin.
Viral girişine izin vermek için karışımı inkübe edin.
Viral RNA, DNA'ya tersine transcribe edilir ve konak genomuna entegre olur.
Organoid medyumu ekleyin ve karışımı bir tüpe aktarın.
Bağlanmamış virüsleri uzaklaştırmak için santrifüjleyin.
Peleti bir bazal membran matrisi içinde karıştırın.
Organoidleri bir kuyucuğa yerleştirin ve katılaşmalarına izin verin.
Matriks, organoidleri hapseden ve yapısal destek sağlayan bir ağ oluşturur.
Organoid proliferasyonunu desteklemek için büyüme faktörleri ile takviye edilmiş organoid medyumu ekleyin.
Bu işlem, transduce edilmiş geni içeren ve daha ileri fonksiyonel analizler için kullanılabilecek tomurcuklanan organoidlerin oluşmasıyla sonuçlanır.
Bu son küçük miktardaki ortam içindeki organoidleri 48 kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğuna aktarın.
Transdüksiyon ortamında önceden hazırlanmış yüksek titreli lentivirüsü organoidlere ekleyin ve resüspande edin. Transdüksiyonun gerçekleşmesi için organoid-virüs karışımını bir kültür inkübatöründe 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin. Bir saat sonra, organoid-virüs karışımına 1 mL organoid kültür ortamı ekleyin, resüspande edin ve karışımı bir mikro santrifüj tüpüne aktararak 850 x g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Organoidleri çöktürmek için süpernatanı uzaklaştırın ve peleti 20 µL buz soğukluğundaki Matrigel içinde yeniden süspanse edin. Damlacığı bir kuyucuğun ortasına yerleştirin. 48 kuyucuklu bir plakada, damlacığın katılaşması için 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. 15 dakika sonra, nikotinamid ve kinaz inhibitörleri ile desteklenmiş 250 µL organoid kültür ortamını dikkatlice ekleyin.