JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:40 dk • August 31st, 2026
Meme kanseri hücresi kültürlerini alın.
İki tip adenovirüs ile birlikte enfekte edin. Bunlardan biri, sürekli aktif bir promotör altında yeşil floresan protein veya GFP geni taşımaktadır.
Diğeri ise SMAD-yanıtlı bir promotör altında, kırmızı floresan protein veya RFP kodlayan bir raporlayıcı gen içerir.
Test kültürüne TGF-beta ekleyin ve inkübe edin.
Virüsler, konak hücreye girmek için reseptöre bağlanır, genleri çekirdeğe iletir ve GFP ekspresyonunu sağlar.
Test hücrelerinde, TGF-beta reseptörüne bağlanır ve SMAD2 ve SMAD3 proteinlerini fosforilleyerek SMAD yolağını aktive eder.
Bu proteinler, SMAD4 ile bir kompleks oluştururlar.
Bu kompleks, raporlayıcı genin promotörüne bağlanarak GFP'ye ek olarak RFP ekspresyonunu sağlar.
Kontrol grubunda SMAD yolu inaktif kalır ve hücrelerin sadece GFP eksprese etmesine izin verir.
Canlı hücrelerin floresan görüntülerini yakalayın.
Her iki sinyalin varlığı, çift adenovirüs transduksiyonu kullanılarak SMAD yolağının aktivasyonunu doğrular.
Adenovirüs enfeksiyonu gününde, 12 kuyucuklu bir plakanın kuyucuklarına, %35 konfluens sağlamak için 50 µL besiyerinde yaklaşık 1,25 x 10⁵ MDA-MB-231 hücresi ekleyin. %10 enfeksiyon pozitifliğine ulaşabilen 2.50 MOI elde etmek için tüm kuyucuklardaki hücreleri 75 µL adenovirüs-CMV-GFP ve 7,5 µL adenovirüs CAGA12-Td-Tomato ile enfekte edin. Ardından, adenovirüs enfeksiyonundan hemen sonra TGF-β'yı işlem kuyucuğuna ekleyin.
37 °C'de, %10 karbon dioksit içeren inkübatörde 24 saat boyunca bekletin. Ertesi gün, canlı hücreleri faz kontrastlı floresan mikroskobu ile görüntüleyin.