JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:36 dk. • August 31st, 2026
Bir lam üzerine monte edilmiş lamelde bulunan, HIV-1 ile enfekte edilmiş insan lenfositleri ile başlayın.
Bu hücreler, viral RNA ve proviral DNA'yı floresanla işaretleyen problarla hibridize edilmiştir.
Spesifik olmayan antikor bağlanmasını önlemek için hücreleri bir bloklama çözeltisi içinde inkübe edin.
HIV-1 kapsid proteinini hedefleyen primer antikorları ekleyin.
Primer antikorların kapsid proteinine bağlanmasını sağlamak için inkübe edin.
Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için hücreleri tamponla yıkayın.
Primer antikorlara bağlanan floresan işaretli sekonder antikorları ekleyin.
Bağlanmamış antikorları yıkayarak uzaklaştırın.
Hücre çekirdeklerini boyamak için DNA-spesifik bir boya ekleyin, ardından fazla boyayı uzaklaştırmak için yıkayın.
Viral DNA, RNA, protein ve konak hücre çekirdeklerini farklı renklerde eş zamanlı olarak tespit etmek için çoklu floresan görüntüleme kullanın.
Bu tek hücreli görselleştirme, enfekte hücrelerde viral DNA, RNA ve proteinlerin eş zamanlı olarak görüntülenmesi yoluyla viral yaşam döngüsünün farklı aşamalarının incelenmesine olanak tanır.
İlgilenilen proteinlerin immünboyaması için, son yıkamanın ardından, her bir lamelin oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyon için 200 microliters bloklama tamponu ile işleme tabi tutun.
İnkübasyonun sonunda, bloklama tamponunu dökün ve %1 sığır serum albumin ile desteklenmiş PBS artı Tween 20 içinde seyreltilmiş 200 mikrolitre ilgili primer antikoru ekleyin. Oda sıcaklığında bir saatlik inkübasyonun ardından, örnekleri uygun bir sekonder antikor ile oda sıcaklığında bir saat boyunca işaretlemeden önce, lamları taze PBS artı Tween 20 ile her yıkama sırasında çalkalayarak iki kez 10 dakika boyunca yıkayın. İnkübasyonun sonunda, lamları taze PBS artı Tween 20 ile her yıkama sırasında çalkalayarak iki kez 10 dakika boyunca yıkayın.
İkinci yıkamadan sonra, çekirdekleri oda sıcaklığında bir dakika boyunca uygun bir nükleer boya ile karşı boyayın, ardından oda sıcaklığında çalkalayarak 10 dakika boyunca PBS ile iki kez yıkayın.