Prototip Köpük Virüsü İntazomlarının Boyut Dışlama Kromatografisi ile Saflaştırılması

Prototip köpüklü virüs veya PFV intasom çökelekleri, monomerik integrazlar, DNA oligomerleri ve protein agregatları içeren bir süspansiyon ile başlayın.

PFV intasomları, viral genomik DNA'yı taklit eden sentetik oligomerlerle kompleks oluşturmuş viral integraz tetramerleridir.

Süspansiyona bir tuz çözeltisi ekleyin ve buz üzerinde inkübe edin. Tuz, intasomlar arasındaki elektrostatik etkileşimi azaltarak çökeleklerin çözünmesini sağlar.

İntazom çözünürlüğünü artırmak için düzenli aralıklarla nazikçe pipetleme yapın.

Kalan çökelteyi pelletlemek için santrifüjleyin ve çözünür intasomları içeren süpernatanı toplayın.

Çapraz bağlı agaroz boncuklarla doldurulmuş, önceden dengelenmiş bir boyut dışlama kromatografisi kolonunu alın ve süpernatantı kolona yükleyin.

Büyük boyutları nedeniyle, protein agregatları ve intasomlar boncuk gözeneklerini baypas ederek daha erken elüe olurlar.

Daha küçük monomerik integrazlar ve oligomerler boncuk gözeneklerine girer ve daha geç elüye olur.

İntazomları içeren erken elüsyon fraksiyonlarını daha sonraki analizler için toplayın.

Temiz bir yüzeyde, yeni bir jilet veya bistüri bıçağı kullanarak 200 µL'lik bir pipet ucunun ucundan 2-4 mm kesip çıkararak iki adet geniş ağızlı pipet ucu hazırlayın. Diyaliz tüpünü diyaliz tamponundan çıkarın. Klibin yakınındaki tüp ucunda kalabilecek diyaliz tamponunun intasom örneğini seyreltmesini önlemek için, fazla diyaliz tamponunu uzaklaştırmak amacıyla küçük bir pipet ucu takılı mikropipet kullanın.

Diyaliz tüpünün bu ucundaki klipsi çıkarın. Kompleksi geri kazanırken, çözeltinin ve çökeleğin mümkün olduğunca fazlasını toplamak önemlidir. Geniş ağızlı pipet ucunu kullanarak, diyaliz tüpünün içindeki çökelek dahil tüm örneği buz üzerindeki 1,5 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Geri kazanılan materyalin toplam hacmini not edin. Toplam hacim tipik olarak yaklaşık 140 µL'dir. Çökelti içeren örnek 200 mM sodyum klorür içerisindedir.

Stok beş molar sodyum klorür çözeltisinin uygun hacmi eklenerek tuz konsantrasyonu 320 millimolar sodyum klorür final konsantrasyonuna yükseltin. Numunenin bulunduğu buz kovasını dört derece santigrat derece sıcaklıktaki soğuk odaya taşıyın. Çökeltiyi yeniden süspanse etmek ve çözmek için geniş ağızlı pipet ucunu kullanarak pipetleme yapın.

En az bir saat boyunca her 20 dakikada bir tekrarlayın. Çökeceğin çoğu çözünmelidir. İntasomu saflaştırmak için, çapraz bağlı bir agaroz boyut dışlama kromatografisi veya SEC kolonunu, dakikada 0.4 mililitre akış hızında SEC çalışma tamponu ile dengeleyin.

Kalan çökeleti çöktürmek için intazom örneğini bir mikrofüjde 4 ˚C'de 10 dakika boyunca 14,000 ×g'de santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice aldıktan sonra, bunu 200 µL'lik bir enjeksiyon döngüsüne yükleyin. Örneği SEC kolonuna uygulayın.

25 mL SEC çalışma tamponu ile elüsyon yapın ve 270 µL'lik 95 fraksiyon toplayın. SEC kromatogramının üç adet A280 ve A260 piki gösterdiğini gözlemleyin.