JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:23 dk. • August 31st, 2026
Kültür ortamındaki, seri dilüsyona uğratılmış, sentezlenmiş viral RNA standart çözeltisi ile başlayın.
Bu dilüsyonlar, numunelerdeki viral RNA'yı nicelendirmek için referans standartlar olarak hizmet eder.
Şimdi, virüsle enfekte edilmiş hücre kültüründen virüs içeren süpernatantı alın.
Bu kültür medyumu, RNA'yı yıkan enzimlere bağlanan ve viral RNA'nın parçalanmasını önleyen bir inhibitör içerir.
Proteinaz K enzimi içeren işlem tamponu ekleyin.
Homojen bir karışım sağlamak için çözeltiyi kısa süreliğine santrifüje tabi tutun.
Numuneleri içeren PCR plakasını termosikletöre yerleştirin.
Öncelikle, proteinaz K'yi aktive etmek için orta dereceli bir sıcaklıkta inkübe edin.
Bu enzim, genomu kapsülleyen viral proteinleri sindirerek viral RNA'nın çözeltiye salınmasını sağlar.
Ardından, enzimi inaktive etmek ve RNA'yı denatüre etmek için daha yüksek bir sıcaklıkta inkübe edin.
Son olarak, işlenmiş örnekleri gerçek zamanlı kantitatif PCR analizine kadar soğuk koşullarda saklayın.
İlk olarak, 199 µL işlem tamponunu bir µL nükleaz içermeyen proteinaz K ile karıştırın. Hücre kültür medyumu kullanarak, pipetleme ve vorteksleme işlemlerini tekrarlayarak, hazırlanan Dengue virüsü 3' UTR RNA'sını 1:10 oranın
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin