İnsan Karaciğer Kanseri Hücrelerinden Hepatit E Virüsü Partiküllerinin Hasadı

Viral partiküller üretmek için hepatit E virüsü (HEV) RNA'sı ile transfekte edilmiş insan karaciğer kanseri hücresi kültürü ile başlayın.

Bazı HEV'ler konakçı kaynaklı bir endozomal membran kazanarak hücreden ayrılırken, diğerleri hücre içinde zarfsız HEV'ler olarak kalır.

Ekstrasellüler HEV'leri toplamak için, hücresel kalıntıları uzaklaştırmak amacıyla kültür süpernatanını toplayın ve filtreleyin.

Enfektifliği korumak için ultra düşük sıcaklıkta saklayın.

Hücre içi HEV'leri toplamak için hücreleri bir tampon çözelti ile yıkayın.

Hücreleri ayırmak için trypsin-EDTA ekleyin, ardından enzimatik aktiviteyi durdurmak için besiyeri ekleyin.

Süspansiyonu bir tüpe aktarın ve santrifüjleyin.

Kalıntı tripsin içeren süpernatanı atın. Peleti resüspanse edin ve bir tüpe aktarın.

Hücreleri sıvı azot içerisinde dondurun ve buz üzerinde çözdürün.

Virüsleri açığa çıkarmak için hücreleri lizlemiş olmak amacıyla dondurma-çözme döngularını tekrarlayın.

Santrifüjleyin, virüsleri içeren süpernatantı toplayın ve ultra düşük sıcaklıkta saklayın.

Altıncı günde, hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için süpernatantı 0,45 mikrometre gözenekli bir filtreden geçirin ve elde edilen hücre kültürü kaynaklı hücre dışı hepatit E virüsünü dört santigrat derece sıcaklıkta saklayın. Hücre kültürü kaynaklı hücre içi hepatit E virüsü partiküllerinin hasadı için, hücreleri PBS ile yıkayın ve 37 santigrat derecede 1,5 mililitre %0,05 tripsin-EDTA ile hücreleri ayırın. Hücreler ayrıldığında, reaksiyonu 8,5 mililitre DMEM ile durdurun ve hücre süspansiyonunu santrifüj için 50 mililitrelik bir tüpe aktarın.

Her bir elektroporasyon için iki mililitrelik bireysel reaksiyon tüplerine 1,6 mililitre DMEM komple medyum ekleyin ve hücreleri resüspande etmek için medyumun 80 mikrolitresini kullanarak hücreleri tüplere aktarın. Hücreleri sıvı azot içinde dondurun ve ardından, elde edilen lizatları 10.0 times g'de 10 dakika boyunca yüksek hızda santrifüjlemeden önce hücreleri buz üzerinde üç kez çözdürün. Sonrasında, hücre kalıntısı peletlerini rahatsız etmeden süpernatantları, -80 degrees Celsius'ta saklanmak üzere yeni tüplere aktarın.