JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 5:02 dk. • August 31st, 2026
Virüsle enfekte edilmiş tavuk yumurtalarından toplanan allantoik sıvı içeren bir rezervuarla başlayın.
Bu sıvı, konakçı kaynaklı kontaminanlarla birlikte virüs partikülleri içerir.
Küçük kontaminantların ve virüslerin geçişine izin verirken büyük kontaminantları tutmak için sıvıyı bir derinlik filtresinden geçirin.
Ardından, filtrelenmiş sıvıyı, bir membran yüzeyi boyunca teğetsel olarak aktığı bir filtrasyon sistemine yükleyin.
Daha küçük kontaminantlar membrandan geçerken, virüs tutulur ve konsantre edilir.
Konsantre virüsü bir yoğunluk gradyanına yükleyin ve santrifüjleyin. Virüs, yoğunluğunun gradyanla eşleştiği noktada belirgin bir bant oluşturur.
Virüs bakımından zengin bandı bir diyaliz kasetine toplayın ve bir tampon çözeltiye yerleştirin. Gradyan bileşenleri dışarı difüze olurken, tampon çözeltideki su yarı geçirgen membran aracılığıyla içeri difüze olur.
Ardından, suyu dışarı çekmek ve saflaştırılmış virüsü konsantre etmek için kaseti hipertonik bir çözeltiye yerleştirin.
Newcastle Hastalığı Virüsü veya NDV'nin saflaştırılması için, öncelikle önceden kurulmuş olan deneysel sistemden 50 mililitre PBS geçirerek sistemi hazırlayın.
Tüpte yaklaşık beş mililitre PBS kaldığında pompayı durdurun. Ardından, bir ila üç mikromolar tutma kapasitesine sahip bir derinlik filtresini hortuma bağlayın. Filtreyi havalandırmak için, derinlik filtresinin apikal tarafındaki ikinci kapağı çıkarın ve ardından sistemden ek 50 mililitre PBS geçirmeye başlayın.
PBS, filtrenin üst kısmındaki hava tahliye deliğinden akmaya başladığında, portu kapatın ve hatlardan PBS akıtmaya devam edin. Ardından, atık kabını yeni ve steril bir toplama kabıyla değiştirin ve allantoik sıvıyı derinlik filtresinden geçirmeye başlayın. Daha sonra, teğetsel akış filtrasyonu (TFF) sistemini açık konfigürasyonda kurun ve makalede açıklandığı şekilde çalıştırın.
Rezervuarda yaklaşık beş mililitre sıvı kaldığında, pompayı durdurun ve rezervuara derinlik filtresinden geçmiş allantoik sıvı ekleyin. Ardından pompa akışını yeniden başlatın. Virüsün parçalanmasını önlemek için, sistem basıncının 10 pound force per square inch değerini aşmadığından emin olmak önemlidir.
Elüsyonu artırmak için peristaltik pompanın hızı ve C-klemplerin kombinasyonu kullanılmalıdır. Rezervuarda 150 ila 10 mililitre allantoik sıvı kaldığında, pompayı durdurun ve 150 ila 20 mililitre ML tamponu ekleyerek tamponu değiştirin. Rezervuarda beş ila 10 mililitre sıvı kaldığında pompayı tekrar durdurun ve ardından iki C-klempi kullanarak atık hatlarını kapatın.
Rezervuara giden retentat hattını ayırın ve 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirin. Ardından akışı yeniden başlatın ve rezervuar tankında sadece birkaç damla sıvı kaldığında işlemi durdurun. Sonrasında, atık hatlarındaki C-kelepçeleri çıkarın ve retentat besleme hattını tekrar rezervuar tankına bağlayın.
Bu sırada, iodixanol yoğunluk gradyanlı ultrasantrifüj hazırlığı için, öncelikle 13,2 ml'lik açık ağızlı ince duvarlı bir ultrasantrifüj tüpüne 0,5 ml %40'lık iodixanol ekleyin. Ardından, sırasıyla 2,5 ml %20'lik iodixanol ve 2,5 ml %10'luk iodixanol ekleyerek kolonu hazırlayın. Ultrasantrifüjden önce, TFF sisteminden elüe edilen virüs solüsyonunun 6 ila 6,5 ml'sini, gradyanı bozmadan dikkatlice iodixanol kolonuna ekleyin.
Ultrasantrifüj işleminden sonra, tüpleri steril bir pens yardımıyla çıkarın. Hedef bant, %10 ve %20 gradyanları arasında geniş bir bant şeklinde olmalıdır. Ardından, bir statif kullanarak tüpü bir beherin üzerine sabitleyin.
Ardından, 5 mL'lik bir şırıngaya 18 gauge'lik 1,5 inçlik bir iğne takın; iğne ile ultrasantrifüj tüpünün yan tarafını delin ve pistonu yavaşça çekerek hedef bandı çıkarın. Makalede açıklandığı gibi virüs çözeltisinden iodixanolü uzaklaştırdıktan sonra, virüsü bir şırınga kullanarak dikkatlice bir diyaliz kasetine enjekte edin. Virüs çözeltisini konsantre etmek için diyaliz kasetini diyaliz tamponundan çıkarın ve küçük, ağzı kapatılabilir plastik bir torbaya yerleştirin.
Ardından, diyaliz kasetinin tamamen suya gömülmesi için torbaya 15 ila 25 mililitre %40 polietilen glikol ekleyin.