Sendai Virüsü Aracılı İnsan Kan Hücrelerinin İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelere Yeniden Programlanması

İnsan periferik kan mononükleer hücrelerinden (PBMC'ler) bir kültür alın.

Yeniden programlama transkripsiyon faktörlerini kodlayan Sendai virüsü ekleyin. Plağın üzerini kapatın ve mühürleyin.

Virüs-hücre temasını artırmak için santrifüjleyin ve inkübe edin.

Virüs füzyonunun ardından, viral RNA, hücresel pluripotens genlerini aktive eden ve yeniden programlamayı başlatmak için soy hattına özgü genleri baskılayan transkripsiyon faktörlerini eksprese eder.

Bu süre zarfında, transduksiyonu gerçekleşmiş PBMC'lerin bir alt kümesi indüklenmiş pluripotent kök hücrelere (iPSC'ler) dönüşür ve adezyon proteinleri eksprese eder.

Bunları matrisle kaplanmış bir kuyucuğa aktarın ve hücreleri santrifüjleyin. Süpernatantı büyüme medyumu ile değiştirin.

İnkübasyon sonrası iPSC'ler matrise tutunurken, transduksiyonu gerçekleşmiş yapışmayan PBMC'ler süspansiyon halinde kalır.

Süspansiyonu kaplanmış bir kuyuya aktarın ve santrifüjleyin. Besiyerini orijinal kuyuya ekleyin ve her ikisini de inkübe edin.

Geriye kalan transduksiyon yapılmış PBMC'ler yeniden programlamayı başlatır, iPSC'lere dönüşür ve yapışır. Bu adım, yeniden programlanmış hücrelerin tutulumunu maksimize eder.

iPSC büyümesini sürdürmek için besiyerini her gün yenileyin.

Bu prosedürde, kan hücrelerini 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın ve bir hemositometre kullanarak sayın. Ardından, transdüksiyon için 3 x 10⁵ hücre hazırlayın ve hücreleri oda sıcaklığında, 515 x g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, süpernatantı vakumla uzaklaştırın ve hücreleri 0,5 ml kan hücresi besiyerinde yeniden süspande edin. Daha sonra, hücreleri kaplamasız bir 24 kuyucuklu plakadaki bir kuyucuğa aktarın. Sendai virüsü karışımını buz üzerinde çözdürün ve süspande edilen hücrelere ekleyin.

Plakayı bir sızdırmazlık filmi ile kapatın ve 30 °C'de 30 dakika boyunca 1,150 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjden sonra hücreleri %5 CO2 içeren 37 °C'de gece boyunca (O/N) inkübe edin. Ertesi gün, bir 24 kuyucuklu plağı vitronektin ile kaplamak için vitronektin solüsyonunu, final konsantrasyonu 5 µg/ml olacak şekilde PBS içerisinde seyreltin.

Ardından, bir kuyucuğa bir mililitre vitronectin ekleyin ve oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Sonrasında, kaplama solüsyonunu uzaklaştırın ve hücreleri ve virüsü içeren tüm medyumu kaplanmış kuyucuğa aktarın. Daha sonra, kalan hücreleri 0,5 mililitre taze kan hücresi medyumu ile toplayın ve hücre içeren kuyucuğa ekleyin.

Ardından, plakayı 35 °C'de 10 dakika boyunca 1,150 ×g'de santrifüj edin ve daha sonra hücreleri gece boyunca 37 °C'de %5 CO2 ortamında tutun. İkinci hücre transferi için, kuyucuğu daha önce açıklandığı gibi 5 µg/ml vitronectin ile kaplayın. Her transdüksiyon için plakanın bir kuyucuğunu kullanın ve hücre süspansiyonunu ilk plakadan yeni kaplanmış vitronectin plakasına aktarın.

Bu sırada, bakım için ilk plakanın bir kuyucuğuna 1 ml iPSC medyumu ekleyin ve 37 °C'de %5 CO2 altında, taze iPSC medyumu ile günlük ortam değişimi yaparak inkübe edin. Koloniler, transduksiyondan sonra 14 ila 21. günlerde ortaya çıkacaktır. Süspansiyon hücrelerini içeren yeni kaplanmış plakayı 1.150 ×g'de 35 °C'de on dakika boyunca santrifüj edin.

Santrifüjlemeden sonra, hücreleri 37 °C'de %5 karbondioksit içeren inkübatörde gece boyunca (O/N) inkübe edin. Ertesi gün, süpernatantı uzaklaştırın ve yerine taze indüklenmiş pluripotent kök hücre medyumu ekleyin. Yapışmış hücreleri, %80 konfluens seviyesine ulaşana kadar günlük medyum değişimi ile muhafaza edin.