Streptavidin Bloklama Deneyi ile İnfluenza Virüsü İçselleştirmesinin Analizi

İnsan akciğer epitelyal hücreleri içeren tüplerle başlayın.

Biyotinlize influenza virüslerini ekleyin ve buz üzerinde inkübe edin. Virüsler, hücre içine alınmadan hücre yüzeyine bağlanır.

Virüsle bağlanmış hücreleri ayırmak için santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve yeniden süspanse edin.

İlk zaman noktası tüpüne, biyotinize virüslere bağlanarak kompleksler oluşturan işaretlenmemiş streptavidin ekleyin.

Streptavidin-biotin virüs kompleksine bağlanamayan florofor işaretli streptavidin ekleyin. Hücreleri yıkayın ve fikse edin.

Virüs internalizasyonuna olanak tanımak için sonraki zaman noktasındaki tüpü daha yüksek bir sıcaklıkta inkübe edin, ardından tekrar buza yerleştirin.

İşaretlenmemiş streptavidin ve viral alımı önleyen bir internalizasyon bloklama ajanı ekleyip inkübe edin. Streptavidin, yüzeye bağlı biyotinlenmiş virüslere bağlanır, ardından yıkama yapın.

Hücreleri fikse edin ve onları permeabilize etmek için deterjan içeren bir tampon ekleyin.

Yıkayın ve hücrelere girip biyotine bağlanan florofor işaretli streptavidini ekleyin.

Örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin.

Sonraki zaman noktasındaki daha yüksek floresan, başarılı viral internalizasyonu doğrular.

Yıkama işlemini bir kez daha tekrarladıktan sonra, tüpleri 10 dakika boyunca buz üzerinde soğutun. Tüpler soğuduğunda, tekrar santrifüjleyin ve pelletleri yeniden süspande etmek için enfeksiyon PBS içinde seyreltilmiş 100 µL biyotinlenmiş virüs kullanın; buz üzerinde bir saat inkübe ettikten sonra santrifüj işlemini tekrarlayın ve PBS ile iki kez yıkayın, sıfırıncı dakika örnekleri için sonraki örnekleri mümkün olduğunca paralel olarak işleyin.

Sıfır dakika artı STV örneklerini işlemek için tüpleri santrifüjleyin, süpernatantı uzaklaştırın ve hücre peletini yeniden süspande etmek için PBS içinde %2 BSA ve %0,1 sodyum azid içeren 15 µL STV kullanın. Buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Ardından santrifüjleyin ve az önce gösterildiği gibi PFA ile fikse ettikten sonra hücreleri yıkamak için iki kez PBS kullanın, örnekleri 4 °C'de saklayın.

30 dakika artı STV örnekleri için. Çökeltme işleminden sonra, örnekleri 37 °C'de 30 dakika inkübe ederek 200 µL %2 BSA içeren PBS içerisinde yeniden süspande edin.

Hücreleri santrifüjleyin ve yıkama ile sabitleme işlemlerinden önce 50 µL PBS içinde %2 BSA ve %0,1 Sodyum azid içeren STV içerisinde yeniden süspande ederek buz üzerinde 30 dakika inkübe edin. Ardından, metin protokolündeki detayları takip ederek tüm örnekleri permeabilize edip STV-Cy3 ile boyadıktan sonra, örnekleri 4 °C'de saklayın. Son olarak, örnekleri akış sitometrisi ile analiz edin.