JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:00 dk • August 31st, 2026
Tedavi grubu olarak besin açısından zengin besiyerinde seri dilüsyonla seyreltilmiş faj süspansiyonu, kontrol grubu olarak ise faj içermeyen besiyeri içeren çok kuyucuklu bir plak ile başlayın.
Her bir kuyucuğa E. coli ekleyin. Başlangıç bakteriyel konsantrasyonunu kaydetmek için bir spektrofotometre kullanarak bazal optik yoğunluğu (OD) ölçün.
Ardından, bakteriyel büyümeye ve faj enfeksiyonuna izin vermek için plakayı inkübe edin.
Kontrol grubunda, bakteriler besinleri kullanarak çoğalır ve OD değerini artır.
İşlem sırasında fage'ler bakteriyel yüzey reseptörlerine bağlanır ve genomlarını sitoplazmaya enjekte ederler.
Viral genom, konak hücre mekanizmasını kullanarak replike olur ve yeni virüs partikülleri şeklinde birleşen viral proteinler üretir. Bu partiküller hücreyi lizleyerek progeniyi serbest bırakır.
Bakteriyel büyümeyi karşılaştırmak için belirli aralıklarla OD değerini ölçün.
Kontrol kuyucukları OD değerlerinde kademeli bir artış gösterirken, faj uygulanan kuyucuklar, daha yüksek faj konsantrasyonlarında daha belirgin azalmalarla birlikte daha düşük OD değerleri sergilemektedir.
Bu, maksimum bakteriyel büyüme inhibisyonu için gereken faj konsantrasyonunun belirlenmesine yardımcı olur.
Başlangıç olarak, çapraz kontaminasyonu önlemek için filtreli uçlar kullanarak mikroplaka analizini kurun. İlk olarak, 96 kuyucuklu mikroplakanın 1 ila 12. sütunlarındaki kuyucuklara 180 µL mTSB ekleyin. Ardından, analizi kurmak için steril 96 kuyucuklu mikroplakaların 1 ila 8. sütunlarında her bir faji on katlı seri dilüsyonda hazırlayın. Mikroplakanın en üstündeki A satırının 1 ila 8. kuyucuklarına 20 µL tekil faj veya faj kokteyli ekleyin.
Faj içermeyen ve boş kontrol için, dokuzuncu ile on ikinci sütunlar arasındaki en üst kuyucuklara 20 µL mTSB ekleyin. Pipetleme yaparken, kuyucuk içeriğini en az beş kez nazikçe ve tekrarlanan aspirasyonlarla karıştırın ve dilüsyonlar arasında uçları değiştirin. Sonuncu H sırasından 20 µL çekin, ardından bir mililitrelik pipet kullanarak dilüe edilmiş kültürden iki ila üç mililitreyi rezervuara aktararak test edilen bakteriyel suş için bir rezervuar hazırlayın.
Çok kanallı bir pipet kullanarak, her ekleme arasında uçları değiştirerek, 1 ile 10 arasındaki sütunlardaki her bir kuyucuğa 20 µL seyreltilmiş bakteri kültürü ekleyin. Mikroplakayı kapatın ve 37 °C'de inkübe edin. İki saatlik aralıklarla mikroplakayı inkübatörden çıkarın ve bir mikroplaka okuyucu kullanarak plakayı okuyun.
Alternatif olarak, plakayı bir mikroplaka okuyucuda inkübe edin ve zaman içindeki değişimleri okuyun.