JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 2:48 dk. • August 31st, 2026
Minimal DNA replikasyonuna sahip, stasyoner fazdaki bir memeli hücresi kültürü alın ve kondisyonlu medyumu toplayın.
Herpes simplex virüsü (HSV) ekleyin ve viral bağlanmayı sağlamak için ara ara çalkalayarak inkübe edin. Bağlanmamış virüsü uzaklaştırmak için yıkayın ve kondisyonlu besiyerini geri ekleyin.
İnkübasyon üzerine virüs, konak membranı ile kaynaşarak nukleokapsidi sitoplazmaya salar.
Viral dsDNA çekirdeğe girer, daireselleşir ve viral DNA replikasyonu için viral proteinleri eksprese eder.
Viral ve konak proteinleri viral DNA'yı açar ve bir RNA primeri sentezler. Ardından, viral DNA polimeraz kompleksi bağlanarak DNA sentezi için primeri uzatır.
Replikasyon ilerledikçe, kültüre bir nukleozid analoğu ekleyin. Bu analog hücrelere girer ve trifosfat formuna dönüştürülür.
Konak DNA replikasyonu minimal olduğundan, analog öncelikle replike olan viral DNA'ya dahil edilerek viral genomları işaretler.
Etiketlenen viral genomlar, ilişkili proteinlerin sonraki proteomik analizleri için hazırdır.
Bu prosedüre, metin protokolünde açıklandığı şekilde MRC-5 hücrelerinin kültüre edilmesiyle başlayın. Ardından, HSV-1'i soğuk tris-tamponlu salin veya TBS içinde seyreltin. Sonraki adımlarda, hücrelerin kurumasını önlemek için üfleyiciyi ve doku kültürü kabinini kapatmak önemlidir.
Büyüme besiyerini MRC-5 hücrelerinden steril bir şişeye transfer etmek için bir pipet kullanın; bu besiyeri enfeksiyondan sonra hücrelere tekrar eklenecektir. Hücrelere yedi mililitre dilüe edilmiş virüs ekleyerek hücreleri enfekte edin. Hücreleri oda sıcaklığında bir saat boyunca her 10 dakikada bir sallayın.
Adsorpsiyonun ardından, inokülumu aspire edin, hücreleri 50 mL oda sıcaklığındaki TBS ile durulayın ve orijinal büyüme besiyerini tekrar ekleyin. Ardından, hücreleri %5 karbondioksit varlığında 37 °C'de inkübe edin. Viral DNA replikasyonunun başlamasından sonra, enfeksiyondan yaklaşık dört saat sonra (hpi), replike olan viral DNA'yı işaretleyin.
Bunun için EdC'yi bir mililitre büyüme ortamında seyreltin ve enfekte hücrelerin hücre kültürü ortamına ekleyerek iki ila dört saat boyunca bekletin.