JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 5:13 dk • August 31st, 2026
Alkin modifiyeli nükleotidlerle işaretlenmiş, viral genomlar içeren hücre çekirdeklerini alın.
Çekirdekleri, biotin-azid ve bakır iyonlarından oluşan bir karışımın içinde süspanse edin ve inkübe edin.
Bakır iyonu, azid ve alkin grubunun kovalent bağlanmasına yardımcı olur.
Santrifüjleyin ve süpernatantı atın.
Tampon içerisinde yeniden süspande edin, aktarın ve çöktürmek için santrifüjleyin.
Lizise yardımcı olmak için peleti şok dondurun, ardından çözdürün.
Çekirdekleri parçalamak için tekrar süspande edin ve sonikasyon uygulayın.
Santrifüjleyin ve protein-viral DNA komplekslerini içeren süpernatantı toplayın.
Kontaminanları uzaklaştırmak için süpernatantı filtreleyin.
Süzüntüyü seyreltin.
Biyotinline edilmiş protein-DNA kompleksleri ile bağlanmayı kolaylaştırmak için streptavidin kaplı manyetik boncuklar ekleyin ve inkübe edin.
Boncukları toplamak için bir manyetik alan uygulayın ve kontaminantları uzaklaştırmak için yıkayın.
Yıkama işlemini tekrarlayın.
Proteinleri ayırmak ve denatüre etmek için bir elüsyon tamponu ekleyin ve ısıtın.
Boncukları ayırın ve elüatı toplayın.
İzole edilen proteinleri hızla dondurun. Daha sonraki analizler için ultra düşük sıcaklıklarda saklayın.
PBS tamamen uzaklaştırıldıktan sonra, nükleer pelet 10 mL'lik click reaksiyon karışımı içinde, 10 mL'lik bir pipetle beş kez nazikçe aşağı yukarı pipetleyerek yeniden süspande edin. Hücre çekirdeklerini daha önce yapıldığı gibi peletlemeden önce, örneği 4 °C'de bir saat boyunca döndürün.
Click reaksiyon karışımını tamamen uzaklaştırın, ardından peleti 10 mililitre PBS içinde nazikçe yeniden süspanse ederek ve tekrar santrifüjleyerek yıkayın. Şimdi, nükleer peleti bir mililitre PBS içinde dikkatlice yeniden süspanse edin ve çözeltiyi 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Santrifüjleme işleminin ardından PBS'yi tamamen uzaklaştırın ve peleti sıvı azotta hızlıca dondurun.
Bu aşamada, pelet -80 °C'de saklanabilir veya prosedüre devam edilebilir. Çekirdekleri lizlemek ve DNA'yı fragmente etmek için, çözünmüş çekirdekleri 50 µL Buffer B1 içinde pipetleyerek yeniden süspanse edin. Süspansiyonu 45 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.
Ardından, üç milimetrelik bir mikro uç probu kullanarak numuneleri %40 amplitütta, her biri 30 saniye sürecek şekilde altı kez sonike edin. Pulslar arasında numuneleri en az 30 saniye boyunca buz üzerinde bekletin. Sonikasyondan sonra numuneler bulanık değil, berrak görünmelidir.
Hücre artıklarını 4 °C'de 10 dakika boyunca 14,0 x G'de santrifüj ederek çökelterek pellete dönüştürün. Pellet boyutu önemli ölçüde azalmalıdır; süpernatantı 10 mikronluk bir hücre süzgecinden filtreleyin ve süzülen kısmı saklayın. Ardından, filtrelenmiş süpernatanta 50 µL Tampon B2 ekleyin.
Biyotinli DNA'yı streptavidin kaplı boncuklara bağlamak için, 300 µL boncuk süspansiyonunu 1,5 mL'lik bir mikrosantrifüj tüpüne aktararak streptavidin manyetik boncuklarını hazırlayın. Her örnek için bir tüp boncuk hazırlayın. Boncukları, yeniden süspansiyon için vorteksleyerek, boncukları ayırmak için bir mıknatısa uygulayarak ve yıkama tamponunu aspire ederek, 1 mL Buffer B2 ile üç kez yıkayın.
Ardından, yıkanmış boncuklara 90 microliter örnek ekleyin. Örneğin geri kalanı, girdi DNA'sı ve protein izolasyonu için kullanılacaktır. Süspansiyonu dört derece celsius'da gece boyunca döndürün.
Ertesi gün, örnekleri manyetik mikrosantrifüj tüp rafına yerleştirin ve süpernatantı uzaklaştırın. Boncukları bir mililitre Buffer B2 içerisinde nazikçe yeniden süspande edin ve ardından dört derece celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca döndürün. Manyetik mikrosantrifüj tüp rafını kullanarak süpernatantı tekrar uzaklaştırın.
Bu kez, boncukları bir mililitre Buffer B3 içinde nazikçe yeniden süspande edin ve dört derece celsius'de beş dakika boyunca döndürün. Mıknatıs kullanarak boncuk karışımından süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, DNA protein komplekslerini elue etmek için boncukları 50 microliter 2x Laemmli örnek tamponu içinde yeniden süspande edin. Ardından, örnekleri 95 derece celsius'de 15 dakika boyunca kaynatın.
Numuneleri mikrofüjde hızlıca santrifüjlemeden önce karışımı vorteksleyin. Numuneleri mıknatısa uygulayın ve elüatı yeni bir tüpe aktarın. Son olarak, numuneleri şok dondurarak 80 °C'de saklayın.
Protein analizini metin protokolünde açıklandığı şekilde gerçekleştirin.