Kateterle İlişkili İdrar Yolu Enfeksiyonunu Modellemek için 3D Baskılı Silikon Kaplı Bir Cihaz

Steril insan idrarı içeren çok kuyulu bir plaka alın.

Test kuyucuklarını bakterilerle aşılayın. Kontrol kuyuları sadece idrar içerir.

Kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonları sırasında biyofilmlerin geliştiği bir kateterin iç yüzeyini taklit eden 3D baskılı, silikon kaplı bir cihazı ele alalım.

Kuyucuklara yerleştirin, plakayı kapatın ve inkübe edin.

Bakteriler cihaz yüzeyine yapışır, idrardaki besinleri kullanır ve biyofilmler oluşturur.

Gevşek bağlı bakterileri gidermek için cihazı bir tamponla durulayın.

Cihazı, boyamak için biyofilm ile etkileşime giren kristal viyole içeren çok oyuklu bir plakaya yerleştirin.

Su ile durulayın ve kurulayın.

Boya-biyofilm etkileşimlerini bozmak ve boyayı çözeltiye salmak için cihazı asit çözeltisi içeren çok kuyulu bir plakaya daldırın.

Bir spektrofotometre kullanarak her bir kuyucuktaki çözeltilerin absorbansını ölçün.

Kontrol kuyucuklarına kıyasla test kuyucuklarındaki daha yüksek absorbans, cihazda biyofilm oluşumunu doğrular ve bu da cihazın kateterle ilişkili idrar yolu enfeksiyonunu modellemeye uygunluğunu gösterir.

Başlamak için havuzlanmış insan idrarı örneğini alın. Belirlenen düzeni izleyerek 96 oyuklu bir plakanın test kuyucuğuna 135 mikrolitre havuzlanmış insan idrarı ekleyin.

Kuyu başına 150 mikrolitrelik bir nihai hacim elde etmek için test edilen her kuyucuğu 15 mikrolitre normalize gece boyunca bakteri kültürü ile aşılayın. Sonraki seri seyreltme doğrulama adımları için bu kültürün en az 100 mikrolitresini ayırın.

Belirlenen kuyucuklara 150 mikrolitre steril havuzlanmış insan idrarı ekleyerek negatif kontrol kuyucukları hazırlayın.

Şimdi mandalları karşılık gelen kuyucuklara yerleştirin. Mandal kapağını plakaya aynı hizada oturana kadar aşağı bastırın ve gerekirse bantlayarak mikroplaka kapağıyla sabitleyin.

Ardından, buharlaşmayı önlemek için mandal modellerini nemli mavi bir rulo içeren kapalı bir plastik küvete veya torbaya yerleştirin. 37 santigrat derecede 24 saat statik olarak inkübe edin.

İnokulum doğrulaması için, ayrılmış kültürü eklemeden önce 96 oyuklu bir plakanın ilk sütununun 2 ila 6. sıralarına 180 mikrolitre PBS ayırın.

Şimdi, 20 mikrolitreyi birinci kuyudan ikinci kuyuya aktarın, yukarı ve aşağı pipetleyerek hafifçe karıştırın. İlk aşı son kuyuya seyreltilene kadar seri seyreltmelere devam edin.

Daha sonra, her seyreltmeden 10 mikrolitrelik noktayı üç kopya halinde uygun katı ortam üzerine yerleştirin. 37 santigrat derecede gece boyunca inkübasyondan sonra, her noktadan kolonileri sayın.

Biyofilm ölçümü için, mandal modelini mikroplakadan çıkarın ve bir alev altında veya bir mikrobiyolojik güvenlik kabini içinde, mandallar yukarı bakacak şekilde ters çevirin. Kullanılmış mikroplakaları atın.

Yapışmamış hücreleri durulamak için mandal kapağını 180 mikrolitre steril PBS alikotları içeren yeni bir mikroplakaya aktarın.

Ardından, aseptik olarak çalışarak, tezgahın üzerine steril bir cam test tüpü rafı yerleştirin ve dübel kapağını tutan takılı raf üst kısmını takın.

Bir mikropipetle, her test tüpüne 600 mikrolitre steril PBS ayırın. Şimdi mandal kapağını rafa yerleştirin ve mandalların test tüpleriyle hizalandığından emin olun. Kapaktaki otoklav bantlarını çıkarın.

Her bir mandalı kapaktan doğrudan aşağıdaki test tüplerine itmek için steril forseps kullanın. Ardından test tüpü kapaklarını değiştirin ve biyofilmle ilişkili hücreleri yerinden çıkarmak için her tüpü 60 saniye vorteksleyin.

Her vorteksli tüpten 100 mikrolitre çıkarın ve daha önce yapıldığı gibi steril PBS'de seri seyreltmeler gerçekleştirin.

Hücreleri kristal menekşe ile boyamak için, 96 oyuklu bir plakanın 24 test kuyucuğuna steril damıtılmış su içinde hacim başına ağırlıkça yüzde 0,1 kristal menekşe 180 mikrolitre pipetleyin. Durulanmış dübel modelini ilgili kuyucuklara yerleştirin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.

Boyamadan sonra dübel modelini plakadan çıkarın ve kullanılmış plakayı atın. Temiz bir küvette, tüm dübel modelini akan musluk suyunda hafifçe çalkalayarak durulayın.

2 yıkamadan sonra mandal modelini ters çevirin ve oda sıcaklığında tamamen kurumasını bekleyin. Daha sonra 96 oyuklu yeni bir plakaya 180 mikrolitre %30 asetik asit ekleyin. Kurutulmuş dübel modelini ilgili kuyucuklara yerleştirin.

İnkübasyon tamamlandığında, peg modelini mikroplakadan çıkarın. Bir mikroplaka okuyucu veya spektrofotometre kullanarak lekeli kuyucukların optik yoğunluğunu 540 nanometrede ölçün.