Genom İçeren Adenoviral Vektörlerin Sezyum Klorür Bazlı Saflaştırılması

Bir adenovirüs ile enfekte edilmiş memeli hücreleri ile başlayın.

Hücreleri liz etmek ve virionları serbest bırakmak için tekrarlayan dondurma-çözme döngüleri uygulayın.

Kalıntıları çöktürmek için lizatı santrifüjleyin. Viral partikülleri içeren süpernatantı toplayın.

Yoğunluk tabanlı ayırma için viral süpernatantı, basamaklı bir sezyum klorür gradyanının üzerine katmanlayın.

Viral partiküllerin yüzerlik yoğunluklarına göre göç etmelerini sağlamak için ultrasantrifüj kullanın.

Tam adenoviral genom içeren bozulmamış viryonlar, paketlenmiş DNA nedeniyle daha yoğundur ve daha alt bir banda çökerken, daha hafif olan boş kapsidler ve kalıntılar üst katmanlarda kalır.

Üst tabakaları uzaklaştırın. Genom içeren virionların bulunduğu alt bandı toplayın.

Virionları tekdüze yoğunluktaki sezyum klorür içinde yeniden süspande edin ve ayrımı optimize etmek ve tam partikülleri konsantre etmek için tekrar ultrasantrifüj işlemine tabi tutun.

Üst katmanları atın ve alt bandı geri kazanın.

Sezyum klorürü uzaklaştırmak için örneği diyalize edin.

Yüksek saflıktaki, genom içeren adenoviral vektörler artık sonraki uygulamalar için hazırdır.

Sezyum klorür gradyan saflaştırması için viral lizatı hazırlamak amacıyla, hücre virüs süspansiyonunu dört kez dondurup çözün. Ardından, viral lizatı oda sıcaklığında sekiz dakika boyunca 50 ×g hızda santrifüjleyin.

Ardından, yüksek kapasiteli adenovirüs içeren süpernatantı toplayın. Sezyum klorür çözeltilerini şu sırayla tüplere dikkatlice ve yavaşça pipetleyin: 0,5 mL 1,5 g/cm³ çözelti, 3 mL 1,35 g/cm³ çözelti ve 3,5 mL 1,25 g/cm³ çözelti. 1,25 g/cm³ tabakasının üzerine yaklaşık 4,5 mL berraklaştırılmış vektör süpernatantı ekleyin.

Yüksek kapasiteli adenovirüs genomu içeren viral partikülleri, boş partiküllerden ve hücre kalıntılarından ayırmak için gradyanları, bir ultrasantrifüjde, salınımlı rotor kullanarak 12 °C'de, en az iki saat boyunca 226.0 ×g'de santrifüjleyin. Santrifüjlemeden sonra, tüplerin üst kısmında hücre kalıntılarından oluşan yaygın bir bant oluşur. Bunun altında iki beyaz bant gözlemlenebilir.

Üst bant boş partikülleri içerirken, alt bant yüksek kapasiteli adenovirüstür. Hücre kalıntıları ve boş partikül katmanlarını dikkatlice uzaklaştırın. Ardından, her tüpün alt bantlarından bir mililitre toplayın.

Virüsü steril 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Toplanan virüs partiküllerine 24 mililitreye kadar 1,35 g/cm³ sezyum klorür çözeltisi ekleyin ve dikkatlice karıştırın. Santrifüj tüplerini 1,35 g/cm³ sezyum klorür içeren virüs çözeltisi ile ağzına kadar doldurun.

Ardından, yavaş hızlanma ve yavaşlama ayarına sahip bir açılı rotor kullanılarak bir ultrasantrifüjde, 12 °C'de 26,0 ×g'de gece boyunca santrifüjleyin. Üst katmanları bir pipet kullanarak yukarıdan alın. Daha sonra, belirgin alt bantta bulunan yüksek kapasiteli adenovirüsü yeni bir pipet ucuyla toplayın.

Son olarak, tampon değişimi için toplanan virüs partiküllerinile diyaliz yapın. Ardından, nihai preparasyonun titrasyonunu yazılı protokoldeki ayrıntılı talimatlara göre gerçekleştirin.