JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 2:27 dk • August 31st, 2026
Kriyomedium içinde gömülmüş, insan hepatositleri içeren donmuş reselülerize sıçan karaciğer dokusu ile başlayın.
Bu dokuda, transduksiyonu gerçekleştirilmiş hepatositler, viral vektör tarafından kodlanan bir raporlayıcı protein olan emeralt yeşili floresan proteini (EmGFP) eksprese ederler.
Hücresel ve doku mimarisini koruyan ince kesitler almak için bir kriyotom kullanın. Kesitleri bir lama aktarın.
Hücre membranını permeabilize etmek için kesitleri hafif bir deterjan ile işlemden geçirin.
Transdükte hücrelerde eksprese edilen floresan rapor proteinine spesifik olarak bağlanan bir anti-EmGFP primer antikoru uygulayın.
Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için yıkayın.
Primer antikora bağlanan, kırmızı bir florofora konjuge edilmiş sekonder bir antikor ekleyin ve ardından yıkayın.
Hücresel DNA'ya bağlanan, DNA'ya özgü mavi floresan bir boya ekleyin.
Bir floresan mikroskop altında, kırmızı floresansın mavi boyalı çekirdeklerle kolokalizasyonu, karaciğer dokusundaki transdükte hepatositlerin viral raporlayıcı proteini başarıyla eksprese ettiğini doğrulamaktadır.
Bir skalpel kullanarak, her bir karaciğer lobundan yaklaşık yarım santimetre kalınlığında ve 1,5 ila 2 santimetre uzunluğunda örnekler kesin. Kesitleri %4 sakroz içeren %4 paraformaldehit içerisinde 4 °C'de 90 dakika boyunca inkübe edin.
Ardından örnekleri, her yıkama işlemi bir dakika sürecek şekilde üç kez PBS ile yıkayın. Yıkama işlemlerinin ardından örnekleri 4 °C'de %8 sükroz içinde gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, örnekleri bir miktar sabitleme ortamı içeren kriyokalıplara yerleştirin.
Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin. Yüklendikten sonra, örnekleri tespit ortamı ile tamamen kapatın ve -80 °C'ye yerleştirin. Donduktan sonra, bir kriyotom kullanarak örneklerden 10 µm'lik kriyokesitler hazırlayın.
Reselülerizasyonu doğrulamak için örnekleri gerektiği şekilde boyayın.