JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:33 dk • August 31st, 2026
Bir insan hücre kültürü alın.
Bir operatöre kaynaşmış tetrasiklin yanıtlı bir promotör altında, koşullu bir konak mRNA'sını hedefleyen shRNA kodlayan lentivirüsleri ekleyin.
Lentivirüs ayrıca, konstitütif bir promotör altına yerleştirilmiş, bir tetrasiklin baskılayıcısı ve bir antibiyotik direnç proteini için genler taşımaktadır.
Viral RNA'nın konak hücrelere aktarılmasına izin vermek için inkübe edin.
RNA, cDNA'ya dönüşür ve konak genomuna entegre olur.
Tetrasiklin represörünün ve antibiyotik direnç proteininin ekspresyonuna izin vererek transdükte hücreleri oluşturmak için yıkayın, besiyeri ekleyin ve inkübe edin. Tetrasiklin represörü operatöre bağlanır ve shRNA ekspresyonunu baskılar.
Yıkayın, antibiyotik takviyeli besiyeri ekleyin ve inkübe edin.
Transdüse edilmiş hücreler antibiyotik direnç proteinini eksprese ederek, antibiyotiğin varlığında seçici olarak hayatta kalmalarını sağlarlar.
Kültüre, bir tetrasiklin analoğu olan doksisiklin ekleyin.
Doksisiklin, tetrasiklin represörüne bağlanarak onun operatöre bağlanmasını engeller ve shRNA ekspresyonunu sağlar.
shRNA, RISC'ye yüklenen ve hedef mRNA'yı degrade eden siRNA'ya işlenir.
Bu işlem, doksisiklin bağımlı koşullu knockdown hücreleri oluşturur.
Stabil hücre hatları oluşturmak için, HCT-116 kolon kanseri hücrelerini ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerini 12 kuyucuklu bir plakaya, kuyucuk başına 50,000 hücre olacak şekilde ekleyerek başlayın.
37 °C ve %5 karbondioksit altında inkübe edin. Hücreler %60-70 konfluens düzeyine ulaştığında, hücreleri PBS ile yıkayın ve her kuyucuğa bir mililitre virüs içeren besiyeri ekleyin. Ertesi gün, virüs içeren besiyerini aspirasyon yoluyla dikkatlice uzaklaştırın.
Ardından hücreleri PBS ile yıkadıktan sonra, tetrasiklin içermeyen FBS içeren besiyerini ekleyin. 72 saat sonra, hücreleri daha önce yapıldığı gibi yıkayın ve virüsle transdukt edilmiş hücrelerin seçimi için mililitre başına bir mikrogram puromisinle takviye edilmiş besiyerini ekleyin. Hücreleri 3 ila 14 gün boyunca puromisin varlığında kültüre ederek virüsle transdukt edilmiş hücreleri seçin.
Virüs ile transduksiyon yapılmış hücrelerin bulunduğu kuyucuklarda puromisin tarafından hücrelerin kısmen öldürüldüğünü gözlemleyin. Transduksiyon yapılmamış hücreler puromisin varlığında büyümeyecektir.
Farklı konsantrasyonlarda doksisiklin içeren ortam ekleyerek ve hücreleri 72 saat boyunca kültüre ederek, puromisin-dirençli HCT-116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinde koşullu nakavt (knockdown) verimliliğini doğrulayın.