JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:51 dk • August 31st, 2026
Saptama için kullanılan bir protein markeri olan HIV-1 p24 antijeni içeren lentiviral vektörleri alın.
p24'ü liz etmek ve serbest bırakmak için bir deterjan ekleyin, ardından örneği seri olarak dilüe edin.
Anti-p24 monoklonal antikorlarla kaplanmış ve spesifik olmayan bağlanmayı önlemek için bir bloklama ajanı içeren bir mikroplaka alın.
Numune dilüsyonlarını ve referans olarak p24 standartlarını ekleyin.
p24 proteininin spesifik bir epitop aracılığıyla antikorlarla etkileşime girmesine izin vermek için inkübe edin, ardından bağlanmamış bileşenleri uzaklaştırın.
p24 üzerindeki farklı epitoplara bağlanan anti-p24 poliklonal antikorlar ile inkübe edin. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırın.
Poliklonal antikorlara bağlanan peroksidaz bağlantılı antikorları ekleyin. Bağlanmamış antikorları uzaklaştırın.
Renkli bir ürüne dönüşen bir peroksidaz substratı ekleyin.
Peroksidazı inaktive etmek ve ürünü stabilize etmek için bir asit ekleyin.
p24 konsantrasyonu ile orantılı olan renk yoğunluğuna karşılık gelen absorbansı ölçün.
Viral titeri belirlemek için standart grafiği oluşturun ve örnek konsantrasyonlarını tahmin edin.
Yüksek bağlanma kapasiteli 96 kuyucuklu bir plakayı, NIH AIDS aşı programının HIV-1 p24 antijen yakalama analiz kiti talimatlarına uygun olarak 1:150 dilüsyonundaki 10 µL monoklonal anti-p24 antikor ile kaplayın. Plakayı 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakayı soğuk PBS içinde 20 µL %0,05 TWEEN-20 ile üç kez yıkayın.
Non-spesifik bağlanmayı önlemek için, plakayı oda sıcaklığında bir saat boyunca 20 microliter %1 sığır serum albümini ile bloke edin. Ardından, plakayı soğuk PBS içinde 20 microliter %0,05 TWEEN-20 ile üç kez yıkayın. Sonrasında, vektörü çift distile su ve Triton X-10 ile seyrelterek konsantre ve konsantre edilmemiş vektör örneklerini %10 nihai konsantrasyona hazırlayın.
Ardından, 5 ng/mL başlangıç konsantrasyonuyla iki katlı seri dilüsyon kullanarak HIV-1 standartlarını hazırlayın. Konsantre ve konsantre olmayan vektör örneklerini dilüsyondan sonra, plakaya üç paralel şeklinde pipetleyin ve 4 °C'de gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün plağı yıkayın, ardından her kuyucuğa 10 µL poliklonal tavşan anti-p24 antikoru ekleyin ve 37 °C'de dört saat boyunca inkübe edin.
Altı yıkamadan sonra, plakayı 37 °C'de bir saat boyunca keçi anti-tavşan yaban turbu peroksidaz ile inkübe edin. Çoklu yıkamanın ardından plakayı oda sıcaklığında 15 dakika boyunca TMB peroksidaz substratı ile inkübe edin. Reaksiyonu durdurmak için 1 N hidroklorik asit ekleyin. Absorbansı, bir absorbans plaka okuyucusu ile 450 nm'de okuyun.