Plazmit Transfeksiyonu Yoluyla Rekombinant Adeno-İlişkili Virüs Üretimi

Besiyerinde süspande edilmiş plazmit karışımı ile başlayın.

İlk plazmid, ilgilenilen geni kodlayan rekombinant adeno-ilişkili virüs (AAV) genomunu taşır.

İkinci plazmit Rep ve Cap proteinlerini kodlar.

Üçüncü plazmit yardımcı proteinleri kodlar.

Plazmit çözeltisine bir transfeksiyon ajanı ekleyin. İyiye karıştırın ve inkübe edin.

Pozitif yüklü transfeksiyon ajanı, negatif yüklü plazmit DNA'ya bağlanarak kompleksler oluşturur.

Kompleksleri memeli hücrelerinin bir monotabakasına ekleyin. İnkübe edin.

Kompleksler, hücrelere endositoz yoluyla girer.

Hücrelerin içinde, plazmit tarafından kodlanan genler viral proteinlerin ekspresyonunu yönlendirir.

Rep proteini viral genomu replike ederken, Cap proteinleri kapsid kabuklarını oluşturur.

Rep proteini, yardımcı proteinlerle birlikte, replike edilen viral genomu kapsidlere paketleyerek eksiksiz AAV partikülleri oluşturur.

İlgi duyulan geni taşıyan rekombinant AAV vektörleri, gen aktarımı uygulamaları için hazırdır.

Metin protokolüne uygun olarak rAAV9 konstrüktları oluşturulduktan ve HEK293 hücreleri kültüre edildikten sonra, birinci günde hücreleri transfekte etmek için 70 µg AAV Rep-Cap plazmidini, 70 µg rAAV9 plazmidini ve 200 µg Ad helper plazmidini 50 ml'lik bir santrifüj tüpünde birleştirin. Tüpe FBS içermeyen oda sıcaklığındaki 49 ml DMEM ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, dörtte bir oranında bir PEI:DNA çözeltisi hazırlamak için tüpe 1.360 µl PEI ekleyin ve iyice karıştırın.

Çözeltiyi oda sıcaklığında 15 ila 30 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, çözeltiden beş mililitre hücrelerin bulunduğu her bir 150 mm'lik kaba ekleyin. Hücreleri 37 °C ve %5 CO₂ ortamında 50 ila 72 saat boyunca kültüre edin.