JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 5:56 dk. • August 31st, 2026
Hücresel proteinler ve viral partiküllerle agregasyon yapmış hücresel DNA içeren bir hücre lizatı ile başlayın.
Hücresel DNA'nın enzimatik yıkımını aktive etmek ve DNA-protein agregatlarını bozmak için önce magnezyum iyonları, ardından bir nükleaz ekleyin.
Kalıntıları ayırmak için santrifüjleyin ve viral partikülleri içeren süpernatanı toplayın.
Süpernatanı, yukarıdan aşağıya doğru artan konsantrasyonlara sahip kesikli bir iodixanol gradyanının üzerine katmanlandırın ve ardından tüpü tamponla doldurun.
Bileşenleri yoğunluğa göre ayırmak için ultrasantrifüj kullanılır. Virüs partikülleri, yüksek ve orta yoğunluktaki katmanlar arasındaki ara yüzde birikir.
Bu ara yüze bir iğne yerleştirin ve viral partikülleri bir tüpe toplayın.
Viral partikül agregasyonunu önleyen, stabilize edici bileşenler içeren bir tampon ekleyin.
Ardından çözeltiyi, membran filtreli bir tüpe aktarın.
Viral partikülleri filtrenin üzerinde yoğunlaştırmak için santrifüjleyin.
Stabilize edici madde takviyeli tamponu ekleyin ve saflaştırılmış viral partikülleri elde etmek için tekrar santrifüjleyin.
Transfekte edilmiş hücreleri toplamak için, kültür ortamını kullanarak hücreleri pipetleme yoluyla yerinden ayırın ve süspanse edin. Ardından hücre süspansiyonlarını steril 50 mililitrelik tüplere aktarın. Hücreleri 50 ×g kuvvetinde beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Ardından her tüpe beş mililitre PBS ekleyin ve tüm süspansiyonları tek bir 50 mililitrelik tüpte birleştirmeden önce hücre peletlerini yeniden süspande edin. Hücreleri 50 ×g'de beş dakika santrifüj ettikten sonra süpernatantı atın. AAV'yi saflaştırmak için peleti 10 mililitre liziz tamponu içinde yeniden süspande edin.
Lizatı eksi 80 derece Celsius'ta veya kuru buz–etanol banyosunda dondurun. Ardından 37 derece Celsius'ta çözdürün. Dondurma ve çözdürme işlemini iki kez daha tekrarlamadan önce lizatı bir dakika boyunca vorteksleyin.
Ardından, çözülmüş lizata bir milimolar magnezyum klorür ekleyin. Daha sonra, mililitre başına 250 ünite nihai konsantrasyona ulaşacak şekilde nükleaz ekleyin. DNA protein agregasyonunu çözmek için çözeltiyi 37 derece Celsius'ta 15 dakika boyunca inkübe edin.
Numuneyi 4.80 ×g'de ve dört santigrat derecede 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından süpernatantı toplayın. Bu sırada %17'lik bir iodixanol gradyan çözeltisi hazırlamak için, beş mililitre 10X PBS'yi 0,05 mililitre bir molar magnezyum klorür, 0,125 mililitre bir molar potasyum klorür, 10 mililitre beş molar sodyum klorür ve 12,5 mililitre yoğunluk gradyanı medyumu ile karıştırın.
Toplam hacmi 50 mililitreye tamamlamak için su kullanın. Metin protokolüne uygun olarak %25, %40 ve %60'lık gradyan çözeltileri hazırladıktan sonra, bir iğne ve şırınga yardımıyla bir polipropilen tüpe beş mililitre %17'lik gradyan çözeltisi yükleyin. Bunu, sırasıyla beşer mililitre %25, %40 ve %60'lık gradyan çözeltileri ile takip edin.
Lizatı gradyanın üzerine katmanlar halinde ekleyin. Ardından tüpü lizis tamponu ile doldurun ve bir mantarla kapatın. Gradyanı 185,00 ×g ve 16 °C'de 90 dakika boyunca santrifüjleyin.
Santrifüj işleminden sonra, 21 gauge bir iğneyi %40 ve %60'lık fraksiyonların kesişim noktasına yerleştirerek %25'lik tabakadan tamamen kaçınarak %40'lık viral fraksiyonu bir şırınga ile toplayın. Viral fraksiyonu, toplam hacim 15 mililitreye ulaşana kadar sterilize edilmiş polooksietilen polooksipropilen veya PEG-PPG blok kopolimer PBS çözeltisi ile karıştırın. Karışımı, 10 kilodalton moleküler ağırlık kesim değerine sahip bir filtre tüpüne yükleyin.
Ardından örneği 2.0 ×g'de ve dört derece Celsius'ta 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Çözeltiyi tüpün altından boşaltın. Daha sonra filtre tüpünü 15 mililitreye tamamlamak için PEG-PPG kullanın.
Tüpü 2.0 ×g'de ve dört °C'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Yeniden doldurma ve döndürme işlemini iki kez daha tekrarladıktan sonra, filtrenin üzerinde kalan saflaştırılmış rAAV9 virüs fraksiyonunu toplayın.