JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:07 dk. • August 31st, 2026
Viral onkogenleri ve bir antibiyotik direnç genini kodlayan retroviral partiküller içeren bir besiyeri alın.
Hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için medyumu santrifüjleyin.
Viral partikülleri içeren süpernatantı toplayın ve endotel hücre kültürünün üzerine ekleyin.
Viral girişine izin vermek için inkübe edin.
Viral RNA, konak genomuna entegre olan DNA'ya tersine yazılarak kopyalanır.
Antibiyotik direnç geni, bir direnç proteini üretir. Onkogenler ise hücre bölünmesini kontrol eden tümör baskılayıcı proteinlere bağlanan ve onları inaktive ederek hücre ömrünü uzatan proteinler üretir.
Besiyerini taze besiyeri ile değiştirin.
Stabil viral DNA entegrasyonunu sağlamak için tekrar inkübe edin.
Besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri yıkayın.
Hücreleri ayırmak için enzimatik bir disosyasyon solüsyonu ekleyin.
Hücre süspansiyonunu aktarın, santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın.
Pelleti yeniden süspande edin ve bir flaska aktarın.
Besiyerine bir antibiyotik ekleyin.
Yalnızca antibiyotik direnç proteinini eksprese eden hücreler hayatta kalır ve böylece viral onkogen proteinlerle ölümsüzleştirilmiş hücreler seçilmiş olur.
Bir gece boyunca inkübasyonun ardından, PA317 hücre kültüründen besiyerini toplayın ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca 30 ×g'de santrifüj ederek berraklaştırın. %50 konfluensle ulaşmış endotelyal hücre kültüründeki EGM besiyerini 12 mL berraklaştırılmış PA317 besiyeri ile değiştirin. Hücreleri dört saat boyunca inkübe edin.
Ardından, 6 mL PA317 besiyerini 6 mL taze EGM besiyeri ile değiştirin ve hücreleri gece boyu inkübe edin. Sonrasında, endotel hücre kültüründen besiyerini uzaklaştırın ve hücrelere 12 mL taze EGM ekleyin. Hücreleri 48 saat daha inkübe etmeye devam edin.
Endotel hücrelerini alt kültürleme aşamasında, besiyerini uzaklaştırın ve hücreleri 12 mL katyon içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, üç mL ticari enzimle ayrıştırma çözeltisi ekleyin ve hücreleri 37 °C'de üç dakika boyunca inkübe edin. Hücre süspansiyonunu 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın ve hücreleri oda sıcaklığında 300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin.
Peletleme işleminden sonra, hücreleri taze EGM besiyerinde tekrar süspande edin ve süspansiyonu üç T75 flask'a eşit şekilde paylaştırın. Kültürlerin hacmini flask başına 12 mililitre EGM olacak şekilde ayarlayın. Ardından, transduksiyon yapılmış endotel hücrelerini seçmek için mililitre başına 20 mikrogram G418 ekleyin.