Floresan İn Situ Hibridizasyonu ile Konak Hücrelerde Viral RNA Dağılımının Belirlenmesi

Viral RNA'ların nükleer ve sitoplazmik bölmeler arasında dağıldığı, permeabilize edilmiş, virüsle enfekte konak hücrelerin bulunduğu bir lam ile başlayın.

Pre-hibridizasyon tamponu ekleyin ve nemli koşullar altında inkübe edin.

Tampon çözelti içindeki bloklama reaktifleri spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke ederken, RNaz inhibitörleri RNazları etkisiz hale getirir ve RNA bütünlüğünü korur.

Tamponu uzaklaştırın ve viral RNA'ya tamamlayıcı, denatüre edilmiş, digoksinen işaretli oligonükleotid probları ekleyin.

Prob-RNA hibridizasyonunun gerçekleşmesi için karanlıkta inkübe edin, ardından tekrar tekrar yıkayın.

Prob-RNA hibritlerini stabilize etmek için bir fiksatif ekleyin, ardından tekrarlayan yıkamalar yapın. Hücre geçirgenliğini korumak için deterjan takviyeli bir tampon ekleyin.

Digoksigenin ile etkileşime giren, yeşil florofor konjugatlı bir anti-digoksigenin antikoru ekleyin ve ardından tekrarlayan yıkamalar yapın.

Kompleksleri korumak için hücreleri fiksle, ardından tekrar yıka.

Çekirdekleri boyamak için DNA bağlayıcı bir boya ekleyin. Fazla boyayı tekrarlanan yıkamalarla temizleyin.

Bir lamel ile kapatın ve mühürleyin.

Konfokal mikroskop altında, viral RNA'nın konak hücre çekirdeği ve sitoplazma arasındaki dağılımını yansıtan yeşil floresansı görüntüleyin.

Gösterildiği gibi üç kez PBS ile yıkadıktan sonra, ikinci bir permeabilizasyon işleminden önce örnekleri 10-15 dakika boyunca PBS içinde %4 formaldehit ile tekrar fikse edin. Ardından, floresan sinyalini korumak ve fotobeyazlamayı önlemek için lamı alüminyum folyo ile örtün.

45 µL hibridizasyon solüsyonu uygulamadan önce hücreleri 2x salin sodyum sitrat ile yıkayın. Nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de bir saat bekledikten sonra, denatürasyon hacmini 10 µL'ye getirmek için ilgilenilen antisense oligonükleotidlere distile su ekleyin. Her slayt başına 35 µL taze hibridizasyon solüsyonu eklemeden önce, oligonükleotidleri 95 °C'de beş dakika boyunca denatüre edin.

Ardından numuneleri, folyo ile koruyarak nemlendirilmiş oda içerisinde 37 °C'de 10-24 saat boyunca inkübe edin. Ertesi gün, hücreleri oda sıcaklığında iki kez 10 dakika boyunca 2X saline sodium citrate ile yıkayın ve ardından 25 °C'de 10 dakika boyunca bir kez 1X saline sodium citrate ile yıkayın.

Son yıkamanın ardından, hücreleri önceden soğutulmuş PBS içinde %4 formaldehit ile buz üzerinde 10-15 dakika boyunca sabitleyin ve ardından taze PBS ile üç kez yıkayın. Daha sonra, örnekleri gösterildiği gibi permeabilize edin ve ardından anti-digoksinin-FITC ile PBS içinde önceden soğutulmuş %0,1 BSA içeren solüsyonda, dört santigrat derecede bir saat boyunca inkübe edin. İnkübasyonun sonunda, lamları taze PBS ile üç kez yıkayın ve örnekleri önceden soğutulmuş PBS içinde %4 paraformaldehit ile dört santigrat derecede 10-15 dakika boyunca sabitleyin.

PBS ile üç kez yıkadıktan sonra, çekirdekleri 0,4 µg/mL DAPI ve PBS içinde önceden soğutulmuş %0,5 Triton-X ile buz üzerinde 15 dakika boyunca işaretleyin ve ardından PBS ile üç son yıkama yapın. Lamları, deneysel olarak uygunsa floresan boncuklar ekleyerek ve uygun bir montaj ortamında kapatın. Fazla montaj ortamını steril mendillerle temizledikten sonra, her bir lama bir kapatma camını şeffaf oje ile birkaç kat sürerek sabitleyin ve deneyin başarıyla gerçekleştirildiğini onaylamak için bir floresan mikroskobu kullanın.

Ardından, örneklendirme işleminin üzerinden bir saat ile bir hafta arasında bir süre geçtikten sonra, 630 kat büyütmede örneklerin görüntülerini toplamak için konfokal mikroskopta görüntüler alınabilir.