Floresan İn Situ Hibridizasyonu ile Konak Hücrelerde Viral RNA Dağılımının Belirlenmesi

Viral RNA'ların nükleer ve sitoplazmik bölmeler arasında dağıldığı, permeabilize edilmiş, virüsle enfekte konak hücrelerin bulunduğu bir lam ile başlayın.

Pre-hibridizasyon tamponu ekleyin ve nemli koşullar altında inkübe edin.

Tampon çözelti içindeki bloklama reaktifleri spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke ederken, RNaz inhibitörleri RNazları etkisiz hale getirir ve RNA bütünlüğünü korur.

Tamponu uzaklaştırın ve viral RNA'ya tamamlayıcı, denatüre edilmiş, digoksinen işaretli oligonükleotid probları ekleyin.

Prob-RNA hibridizasyonunun gerçekleşmesi için karanlıkta inkübe edin, ardından tekrar tekrar yıkayın.

Prob-RNA hibritlerini stabilize etmek için bir fiksatif ekleyin, ardından tekrarlayan yıkamalar yapın. Hücre geçirgenliğini korumak için deterjan takviyeli bir tampon ekleyin.

Digoksigenin ile etkileşime giren, yeşil florofor konjugatlı bir anti-digoksigenin antikoru ekleyin ve ardından tekrarlayan yıkamalar yapın.

Kompleksleri korumak için hücreleri fiksle, ardından tekrar yıka.

Çekirdekleri boyamak için DNA bağlayıcı bir boya ekleyin. Fazla boyayı tekrarlanan yıkamalarla temizleyin.

Bir lamel ile kapatın ve mühürleyin.

Konfokal mikroskop altında, viral RNA'nın konak hücre çekir