JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:35 dk • August 31st, 2026
Adeno-ilişkili virüs (AAV) vektörleri ve konak kaynaklı kontaminantlar içeren filtrelenmiş bir hücre lizatı ile başlayın.
Lizatı heparin bazlı bir afinite kolonundan geçirin.
Viral kapsid proteinleri, negatif yüklü heparin gruplarına elektrostatik olarak bağlanır.
Bağlanmamış kontaminanları uzaklaştırmak için kolonu bir tampon çözelti ile durulayın.
Membranöz kalıntıları çözmek için deterjan içeren bir tampon uygulayın.
Deterjan içermeyen tamponla tekrar durulayın.
İyonik bir ortam oluşturmak için katyonlarla desteklenmiş bir tampon ekleyin, ardından zayıf bağlanan safsızlıkları uzaklaştırmak için orta derecede tuz içeren bir tamponla yıkayın.
Kapsid-heparin etkileşimlerini bozmak ve viral partikülleri elüye etmek için yüksek tuzlu bir tampon ekleyin.
İntakt viral partiküller bakımından zenginleştirilmiş elüsyon fraksiyonlarını toplayın ve bunları filtre membranlı santrifüj konsantratör tüplerine aktarın.
Fazla tamponu uzaklaştırmak için tüpleri santrifüjleyin, ardından konsantre viral fraksiyonları bir tüpe toplayın.
Kalıntı viral partikülleri geri kazanmak ve verimi maksimize etmek için membranı tamponla durulayın.
Ham lizatı dört derece Celsius'ta gece boyunca çözdürün.
Çözündükten sonra, 0,22 mikronluk bir filtre kullanarak süzün. Saflaştırma basamaklarından hemen önce, kullanılan her bir heparin-Sepharose kolonu için dört mililitre filtre ön işlem tamponu ekleyerek santrifüj konsantratörünü pasivize edin. Boruları bir peristaltik pompaya yerleştirin.
Çözeltileri ve medyaları sırayla çalıştırın. Beş mililitrelik bir heparin-Sepharose kolonunu tüplere bağlayarak ve kolondan 25 mililitre Bazell DMEM geçirerek kromatografi için hazırlık yapın. Ardından, filtrelenmiş ham lizattan 0.2 micromolar'ı saniyede bir ila iki damla akış hızıyla kolona yükleyin.
Kolonu, magnezyum ve kalsiyum içeren 300 millimolar sodyum klorürlü HBSS ile beş kez beşer mililitre elüsyon yapacak şekilde sırasıyla yıkayın ve beş elüsyonu E1'den E5'e kadar etiketleyin. Hazır olduğunda, ön işlem tamponu içeren santrifüj konsantratörünü 900 ×g'de iki dakika boyunca döndürün. Akış sıvısını atın. Santrifüj konsantratör filtresini, 1000 ×g'de iki dakika boyunca döndürerek dört mililitre magnezyum ve kalsiyumlu HBSS ile yıkayın.
Ardından, elüsyon E2'yi santrifüj konsantratörüne ekleyin ve 1000 ×g'de beş dakika boyunca döndürün. Akış sıvısını atın. Benzer şekilde, konsantre virüs yaklaşık bir mililitre olana kadar elüsyon E3'ü santrifüj konsantratöründe döndürün.
Konsantre virüsü, P200 filtreli uç kullanarak santrifüj konsantratöründen çıkarın ve steril 1,5 milliliter santrifüj tüpüne toplayın. Virüsü topladıktan sonra, santrifüj konsantratörünü magnezyum ve kalsiyum içeren 200 microliters HBSS ile durulayın. Membrana yapışmış olan tüm virüsleri yerinden çıkarmak için 30 saniye boyunca kuvvetlice pipetle çekip boşaltın ve konsantre virüsü aynı 1,5 milliliter santrifüj tüpünde toplayın.
Tüpü iyice karıştırın.