JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:07 dk. • August 31st, 2026
Merkezinde bir damla embriyo kültür medyumu bulunan ve buharlaşmayı önlemek için mineral yağ ile kaplanmış bir mikroenjeksiyon kabı alın.
Kabı bir ters mikroskop altına yerleştirin.
Mikroenjeksiyon kapilerini ve tutucu pipeti, mikroskop altında bir mikromanipülatör düzeneğine yerleştirin.
Mikroenjeksiyon kapilaritesi, transgen taşıyan lentiviral vektörlerin bir süspansiyonu ile doldurulur.
Ardından, döllenmiş sıçan embriyolarını ortama aktarın.
Tutma pipeti ile vakum uygulayarak bir embriyoyu sabitleyin.
Daha yüksek büyütme altında, mikroenjeksiyon kapilerini embriyonun hücre dışı glikoprotein kılıfı olan zona pellucida üzerinden geçirin ve lentiviral süspansiyonu perivitelin boşluğa enjekte edin.
Ardından, enjekte edilen embriyoları bir kültür kabına aktarın ve inkübe edin.
Virüs embriyoya girer ve transgeni içeren genomunu sitoplazmaya salar.
Daha sonra, tersine yazılarak DNA'ya dönüştürülür ve embriyonun genomuna entegre olarak transgeni dahil eder.
Transdükte edilen embriyolar artık işlemeye hazırdır.
Tek hücreli evredeki embriyoların zona pellucida altına lentiviral vektör mikroenjeksiyonu için, filamanlı bir pipet çekici kullanarak mikroenjeksiyon borosilikat cam kapilerleri hazırlayın. Filaman her değiştirildiğinde veya yeni bir cam kapiler kullanıldığında, optimal parametreleri belirlemek için bir Ramp testi gerçekleştirin.
Ardından, bir biyosafety laminar akış kabini altında, bir mikroloader ucu kullanarak her bir mikroenjeksiyon pipetine yaklaşık iki mikrolitre taze çözülmüş lentiviral solüsyon yükleyin. 60 milimetrelik bir Petri kabının kapağının merkezine 10 mikrolitrelik bir M2 ortam damlası ekleyin. Ortamın üzerini mineral yağ ile kapatın; tutucu pipeti ve virüs yüklü mikroenjeksiyon kapilerini bir mikromanipülatöre monte edin.
Mikroenjeksiyon kabını ters mikroskop altına yerleştirin ve 15 ila 20 adet tek hücreli evredeki embriyoyu mikroenjeksiyon kabındaki M2 damlasına aktarın. Tutucu pipet ile bir embriyoyu yakalayın; 40 kat büyütme ve cam kapilar kullanarak lentiviral çözeltiyi zona pellucida altındaki perivitelin boşluğa enjekte edin ve virüs iletildikten sonra kapiları bir süre zona pellucida altında tutun. Tüm embriyolar enjekte edildiğinde, ince bir pipet kullanarak enjekte edilen hücreleri kültür kabına geri aktarın ve kapı, implantasyona kadar hücre kültürü inkübatörüne geri yerleştirin.