JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:45 dk. • August 31st, 2026
Polihistidin etiketli viral integraz eksprese eden bakteriyel hücre süspansiyonu ile başlayın.
Bakteri membranlarını parçalamak ve integrazı serbest bırakmak için süspansiyonu sonikasyona tabi tutun.
Lizatı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Hücre kalıntılarını çöktürmek için yüksek hızda santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.
Ardından, nikel yüklü reçine ile doldurulmuş bir kromatografi kolonu alın ve bunu tamponla dengeleyin.
Berraklaştırılmış lizatı kolona yükleyin.
Histidin içeren proteinler nikele zayıf şekilde bağlanırken, polihistidin etiketli integraz güçlü bir şekilde bağlanır.
Bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için tampon ile yıkayın, ardından lineer olarak artan imidazol konsantrasyonuna sahip elüsyon tamponu ekleyin.
İmidazol, nikel bağlanması için histidinle rekabet eder ve integrazı serbest bırakır.
Fraksiyonları toplayın ve alikotları yükleme tamponu içeren tüplere aktarın.
Proteinleri denatüre etmek için ısıtın, ardından poliakrilamid jelin üzerine yükleyin.
Elektroforezi gerçekleştirin ve protein bantlarını analiz edin.
Herhangi bir kontamine protein içermeyen, saf integraz içeren fraksiyonları belirleyin ve saflaştırılmış viral integraz elde etmek için bunları birleştir
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin