JoVE Encyclopedia of Experiments
Mikrobiyoloji
0 görüntüleme • 3:45 dk • August 31st, 2026
Polihistidin etiketli viral integraz eksprese eden bakteriyel hücre süspansiyonu ile başlayın.
Bakteri membranlarını parçalamak ve integrazı serbest bırakmak için süspansiyonu sonikasyona tabi tutun.
Lizatı bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın.
Hücre kalıntılarını çöktürmek için yüksek hızda santrifüjleyin ve süpernatantı toplayın.
Ardından, nikel yüklü reçine ile doldurulmuş bir kromatografi kolonu alın ve bunu tamponla dengeleyin.
Berraklaştırılmış lizatı kolona yükleyin.
Histidin içeren proteinler nikele zayıf şekilde bağlanırken, polihistidin etiketli integraz güçlü bir şekilde bağlanır.
Bağlanmamış proteinleri uzaklaştırmak için tampon ile yıkayın, ardından lineer olarak artan imidazol konsantrasyonuna sahip elüsyon tamponu ekleyin.
İmidazol, nikel bağlanması için histidinle rekabet eder ve integrazı serbest bırakır.
Fraksiyonları toplayın ve alikotları yükleme tamponu içeren tüplere aktarın.
Proteinleri denatüre etmek için ısıtın, ardından poliakrilamid jelin üzerine yükleyin.
Elektroforezi gerçekleştirin ve protein bantlarını analiz edin.
Herhangi bir kontamine protein içermeyen, saf integraz içeren fraksiyonları belirleyin ve saflaştırılmış viral integraz elde etmek için bunları birleştirin.
İşleme, prototip köpüklü virüs integraz eksprese eden bir E.coli peletini buz üzerinde çözerek başlayın. Tüp buz üzerindeyken, 0,5 inç çapında bir biyo boynuz ve 0,125 inç çapında konik bir mikro uçla donatılmış bir sonikatör kullanarak %30 genlikte 30 saniye boyunca sonikasyon uygulayın. Sonikasyon sonrası hücre örneğini soğuk bir ultrasantrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de 60 dakika boyunca 120,000 ×g hızda santrifüjleyin.
Santrifüjasyonun ardından belirgin bir pelet oluşmalıdır ve süpernatant sarı renkli olabilir. Süpernatantı soğuk bir 50 mililitrelik konik tüpe aktarın. Ardından, 1,5 mililitre nikel yüklü reçine içeren 110 milimetre uzunluğunda ve beş milimetre çapındaki FPLC kolonunu hazırlayın.
İlk olarak, kolonu FPLC cihazına bağlayın ve tampon çözelti uygulayın. Cihaz; iletkenlik ve 280 nanometredeki UV absorbans değerlerine ait gerçek zamanlı verileri toplamalıdır. İletkenlik ve UV okumaları stabilize olmalıdır.
Gerekirse, okumalar stabilize olana kadar kolon üzerinden tampon akıtmaya devam edin. Bir superloop kullanarak, protein örneğini 0,15 mililitre/dakika akış hızıyla ve maksimum 0,5 megapaskal basınç limitiyle kolona yükleyin. Superloop'u AKTA FPLC'ye bağlayın.
Kolonun yıkanması ve proteinlerin elüe edilmesinin ardından; başlangıç akışının, yıkama aşamasının ve 280 nanometre absorbans pikinin fraksiyonlarından 15 µL'lik alikotlar alın ve her bir örneğe 15 µL 2X SDS-PAGE örnek tamponu ekleyin. Örnekleri üç dakika boyunca kaynatın. Her bir örnekten 10 µL'yi ve dört µL önceden boyanmış protein standartlarını %10'luk SDS-PAGE jellerine yükleyin.
Neredeyse saf prototype foamy virus integraz içerdiği görülen fraksiyonları belirlemek için jeli görsel olarak inceleyin. Bu fraksiyonları birleştirin ve pipetleme yaparken hacmi not edin. Bu hacim tipik olarak 8 ila 10 mL'dir.