JoVE Deneyler Ansiklopedisi
Mikrobiyoloji
0 görüntülenme • 3:55 dk. • September 30th, 2026
Endojen hedef proteini ekspres eden bir insan kanser hücresi kültürü alın ve besiyerini uzaklaştırın.
Florofor etkili hedef proteini kodlayan bir gen taşıyan rekombinant adenovirüs süspansiyonu alın.
Virüs ile hücre yüzeyi arasında yakın temas sağlamak için hücrelere küçük bir hacimde viral süspansiyon ekleyin.
Viral bağlanmayı sağlamak için ara ara çalkalayarak inkübe edin.
Kültüre ek besiyeri ekleyin.
Ardından, endojen hedef proteinin mRNA'sını hedeflemek için bir siRNA–kalsiyum fosfat kompleksi ekleyin ve inkübe edin.
Kalsiyum fosfat siRNA alımını artırır ve siRNA, RISC'ye yüklenir.
siRNA–RISC kompleksi daha sonra hedef mRNA'ya bağlanarak onu parçalar ve protein ekspresyonunu inhibe eder.
Eş zamanlı olarak, adenovirüs hücreye girer ve florofor işaretli hedef proteinin ekspresyonunu yönlendiren DNA'sını serbest bırakır.
Bu işlem, endojen hedef proteinin tüketilmesiyle eş zamanlı olarak floroforla işaretlenmiş proteinle değiştirilmesine olanak tanır.
Hücreleri tampon ile yıkayın ve hedef proteini analiz etmek için floresan görüntüleme yapın.
Her koşul için 1,5 mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpü etiketleyin ve 400 mikrolitre ılık alpha MEM minus ekleyin. Virüs alikotlarını buz üzerinde yava
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin