C. elegans Pozitif bütanon Öğrenme, Kısa vadeli ve uzun vadeli ilişkilendirilebilir Bellek Tahliller

Aşağıdaki deneyin genel amacı, model olarak C elegans kullanılarak, gıda ile kemoatraktan bütan arasında öğrenilen pozitif bir ilişkilendirmeye dair kısa ve uzun süreli hafızayı test etmektir. Bu, öncelikle senkronize edilmiş, iyi beslenmiş genç yetişkin solucanların bir saat boyunca aç bırakılmasıyla gerçekleştirilir.

Ardından solucanlar, kısa süreli çağrışımsal bellek için kütle koşullanması (mass conditioning) ve uzun süreli çağrışımsal bellek için aralıklı koşullanma (spaced conditioning) yoluyla, besin ve bilinen butan varlığında eğitilir. Koşullanmadan sonra, bilinen butana doğru kemotaksi ölçülür ve naif kemotaksi ile karşılaştırılır. Bellek tutulumunu incelemek amacıyla, öğrenme indeksindeki değişikliklere dayanarak, öğrenilmiş besin-bilinen butan çağrışımının kısa ve uzun süreli çağrışımsal bellek süresini gösteren sonuçlar elde edilir.

Bu yöntem; normal yaşlanma ve nörodejeneratif hastalık durumlarında nöronal fonksiyon için hangi genetik yolların gerekli olduğu ve öğrenme ile hafızanın nasıl geliştirilebileceği gibi, bilişsel yaşlanma ve hastalık alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bilişsel bozulma koşulları altında solucanlar, 1 ml OP 50 e coli ile ekilmiş 100 mm yüksekliğindeki büyüme ortamı plaklarında standart yöntemler kullanılarak hazırlanır. Plaka başına yaklaşık 5.000 veya daha az solucan yoğunluğunda genç yetişkinler kullanın.

M9 tamponunu plakaya nazikçe dökerek ve solucanları serbest bırakmak için plakayı sallayarak solucanları toplayın. İstenmeyen bakterilerin yerinden çıkmasına neden olabilecek aşırı çalkalamadan kaçınmaya çalışın. Ardından, plakayı eğin ve tampon-solucan karışımını köşeden çekerek alın.

P 1000 pipet kullanarak solucanları 15 mililitrelik konik tüpe aktarın. Plakada solucan kalmışsa, solucanları tüpün kenarına pipetle itmemeye dikkat edin.

Bu adımı bir ila iki kez tekrarlayın. Solucanların yerçekimi ile tüpün dibine çökmesini bekleyin. En iyi sonuçlar için santrifüjleme önerilmez.

Çökelti oluştuktan sonra, süpernatantı vakumla uzaklaştırın ve en az üç ila dört mililitre M nine tamponu ile yıkayın. Açlığı önlemek için hızlı çalışın. Bu prosedürü, toplamda üç yıkama olacak şekilde iki kez daha tekrarlayın.

Bu aşamada, daha sonra gösterilecek olan ve solucanları eğitime önceden hazırlamak amacıyla kullanılacak kemotaksi deneylerinde kontrol grubu olarak hizmet etmek üzere bir grup solucan ayrılabilir; tüpe üç ila dört mililitre M9 tamponu ekleyin ve solucanların oda sıcaklığında bir saat boyunca aç kalmasını sağlayın. 500 mikrolitre OP50 E. coli ekilmiş 60 milimetrelik NGM plaklarının kapaklarının iç kısmına iki mikrolitre %10 butanon içeren %95 etanol sürerek koşullandırma plakalarını hazırlayın. Aç bırakılan solucanların bulunduğu tüpten süpernatantı uzaklaştırın ve her bir koşullandırma plağına 100 ila 200 mikrolitre solucan aktarmak için bir P1000 pipet kullanın. Koşullandırmanın ardından, koşullandırma plakalarını oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin.

Solucanları plakalardan yaklaşık 1 mL M9 tamponu ile yıkayın ve 15 mL'lik konik bir tüpe aktarın. Tampon berrak görünene kadar daha önce gösterilen nazik yıkama yöntemlerini tekrarlayın. Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, ek zaman noktalarını temsil eden plakaları hazırlamak amacıyla, 1x mast çağrışımsal öğrenmesi için zaman sıfır grubu olarak hizmet edecek bir grup solucan ayrılabilir ve kemotaksi analizinde test edilebilir.

100 ila 200 mikrolitre solucanı, ekim yapılmış 60 milimetrelik NGM plaklarına aktarın. Bu koşullandırma sonrası plakalarını oda sıcaklığında 0,5, 1 veya iki saat inkübe edin. Her zaman noktasından sonra solucanları plakalardan 15 mililitrelik konik bir tüpe nazikçe yıkayarak aktarın ve bu işlemi bir ila iki kez daha tekrarlayın.

M9 tamponu ile aynı nazik yıkama prosedürleri uygulandıktan sonra, kısa süreli çağrışımsal bellek, daha sonra gösterilecek olan kemotaksi testi kullanılarak test edilir. Koşullandırma plakalarını ve solucanları kısa süreli eğitim için gösterildiği şekilde hazırlayın, ancak solucanların oda sıcaklığında yalnızca 30 dakika inkübe edilmesine izin verin. İnkübasyonun ardından, solucanları daha önce gösterildiği gibi toplayın.

Bunları EKİLMEMİŞ 60 milimetrelik NGM plaklarına aktarın. Solucanları oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ekilmemiş plaklarda aç bırakın. Solucanlar aç bırakıldıktan sonra, solucanları M nine tamponu ile yıkayın ve tekrar 15 mililitrelik konik tüpe yerleştirin. Toplam yedi kondisyonlama bloğu ve altı aç bırakma bloğu tamamlanana kadar bu adımları tekrarlayın.

Koşullandırma tamamlandığında, solucanları koşullandırma plakalarından yıkayarak tekrar konik bir tüpe aktarın. Daha önce gösterildiği gibi, koşullandırmanın hemen ardından yedi farklı zaman aralığında ilişkisel öğrenmeyi test etmek için bir solucan grubu kullanılabilir. Geriye kalan solucan popülasyonunu, bir mililitre OP 50 içeren 100 milimetrelik HGM plakalarına aktarın.

Popülasyonu destekleyecek kadar bakteri olduğundan emin olmak için her plakaya tekrar 100 ila 200 µL solucan uygulayın. Gıda-butan ilişkisinin uzun süreli çağrışımsal belleğini test etmek amacıyla, uzun süreli çağrışımsal bellek zaman noktalarını temsil eden 16, 24 veya 40 saat boyunca, kondisyonlama sonrası plakaları 20 °C'de inkübe edin. Solucanları plakalardan nazikçe 15 mL'lik konik bir tüpe yıkayın ve her zaman noktasından sonra M9 tamponu ile tekrar bir ila iki kez yıkayarak solucanları kemotaksi deneyinde test edin.

Kemotaksi analiz plakalarını hazırlamak için, yerleştirilmemiş 100 milimetrelik NGM plakalarının altına, burada görüldüğü gibi yan tarafa yakın üç noktaya işaretler koyun. Koku maddesi ve kontrol noktalarına bir mikrolitre bir molar sodyum azid damlatın. Felç edici ajanların difüzyonunu en aza indirmek için bu işlemi analiz başlangıcından en fazla 15 dakika önce yapın.

Sıradaki adımda, işaretli analiz plağındaki uygun noktalara %95 etanol ve %10 butonon'dan birer mikrolitre damlatın. Bu işlem, daha önce damlatılmış sodyum azid'in üzerine uygulanmalıdır. Çökmüş solucanların bulunduğu tüpten M 9 tamponunun mümkün olduğunca fazlasını uzaklaştırın.

Deney plakasının başlangıç noktasına, önceden kesilmiş uçlu bir P 20 pipet kullanarak üç beş mikrolitrelik aralıklarla toplam 15 µL solucan aktarın. Ardından, bir Kim wipe köşesini küçük bir uç oluşturacak şekilde bükün ve agar tabakasını delmemeye dikkat ederek fazla M9 tamponunu bununla emdirin.

Fazla tamponun uzaklaştırılması, solucanların assay plakasına salınmasını sağlar. Solucanları saymak için görüntüleme kullanılıyorsa, bu salım işleminden hemen sonra başlangıç noktasının çekilen bir görüntüsü, bir assay plakasındaki toplam hayvan sayısını verecektir. Kemotaksi assay plakasını inkübasyondan sonra oda sıcaklığında bir saat boyunca inkübe edin; ardından başlangıç noktasındaki, etanol ve buton lekelerindeki solucan sayısının yanı sıra assay plakasındaki toplam solucan sayısını belirleyin.

Genellikle sodyum azid ile felç edilen solucanlar, damlatılan noktaların bir santimetrelik yarıçapı içinde olacak ve dümdüz görünecektir. Birçok hayvanın üst üste yığıldığı durumlarda, solucanlar elle sayılabileceği gibi görüntüleme ve analiz yazılımları kullanılarak da miktarları belirlenebilir. Sonuçların kolaylığı ve güvenilirliği açısından biz ikincisini tercih ediyoruz.

Başlangıçtaki etanol ve butone lekelerindeki solucanlar sayıldıktan sonra, burada görüldüğü gibi KeyAx indeksi hesaplanır. %10 Butone'ye yanıt veren vahşi tip solucanlar için tipik saf kemotaksi indeksi yaklaşık 0,2'dir. Kütle veya aralıklı eğitim, genellikle sıfırıncı zamandaki KEMOTAKSİ indeksini 0,7 ile 0,8'e yükselterek yaklaşık 0,6'lık bir öğrenme indeksi sağlar.

Saf kemotaksi, solucanların uygun bakımına karşı oldukça hassastır. Bu şekil, iyi beslenmiş ve aç bırakılmış saf solucanlar arasındaki CI'daki belirgin farkı göstermekte ve doğru tekniğin önemini vurgulamaktadır. Hafıza tutulumu, yabani tip hayvanlarda öğrenme indeksi sıfıra eşit olduğunda, kemotaksi indeksinin saf seviyelere dönmesi için geçen süre ile yansıtılır.

Kısa süreli ilişkisel bellek, yaklaşık iki saat süren kitle eğitiminden bir saat sonra azalmaya başlar ve karşılaştırmalı olarak transkripsiyon faktörü Creb'den bağımsızdır. Uzun süreli ilişkisel bellek ise genellikle, 40 saate kadar süren alan eğitiminden 16 saat sonrasına kadar belirgin bir azalma göstermez ve Creb bağımlıdır. Bu prosedür uygulanırken, kemotaksi deneylerinin açlıktan veya ortamdaki aşırı kokulardan etkilenebileceği ve ayrıca belleğin ve solucanların aşırı fiziksel ajitasyonla bozulabileceği unutulmamalıdır.