Çoklu-fare nöroanatomik Manyetik Rezonans Görüntüleme

Bu prosedürün genel amacı, birden fazla fare beyni MRI kullanarak canlı veya fikse edilmiş farelerle yüksek kapasiteli fenotipleme gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle her bir fare anestezi altına alınarak gerçekleştirilir. Ardından in vivo tarama için, her fare önce boyutuna uygun bir kızağa yerleştirilir, daha sonra bir yükleme dizisine monte edilerek mıknatısın boşluğuna konumlandırılır.

Veya ex vivo görüntüleme için, transkardiyak perfüzyon gerçekleştirin, kafatası yapısını izole edin ve bunu, ardından mıknatıs boşluğunda konumlandırılmış 16 kanallı bir solenoid bobin dizisine yerleştirilen görüntüleme tüplerine koyun. Nihayetinde, fenotiplemeye uygun, fare beynindeki majör ve minör yapıları gösteren yüksek kaliteli beyin görüntüleri içeren üç boyutlu manyetik rezonans görüntüleme hacimleri elde edilebilir. Bu tekniğin histoloji gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, örneklerin genel anatomisini hala kafatasları içerisindeyken koruması ve tüm beyin kapsamı ile üç boyutlu analize olanak sağlamasıdır.

Bu yöntem, hastalıkların fare modelinde fenotipleri temsil eden anatomik farklılıklar ile genler arasındaki ilişki gibi biyomedikal alanlardaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Genel olarak, bu tekniği yeni kullanmaya başlayanlar, yüksek verimli beyin görüntüleme için gerekli olan özel fare yükleme ve radyo frekansı bobin dizilerinin geliştirilmesini en zorlayıcı aşama olarak bulacaklardır. Bu protokole başlamadan önce, tanımlama ve ağırlık ölçümü gibi ilk prosedürler dahil olmak üzere tüm kütle işleme prosedürleri için kurumunuzun yerel hayvan bakım komitesinden, kurumsal hayvan bakım ve kullanım komitesinden veya eşdeğer bir merciden onay alın.

Hayvanların kayıtları biyolojik güvenlik kabini altında gerçekleştirilmelidir. Ardından, hayvanları MRI indüksiyon odasına taşımak üzere otoklavlanabilir plastik bir kaba aktarın. Taranacak hayvanları, %4 ISO fluran ve dakikada dört litre oksijen kullanarak ön ısıtmalı indüksiyon odasında anesteziye alın.

Hayvanlar, pati sıkma işlemine yanıt vermediklerinde tamamen anestezi almış sayılırlar. Özel kızak içerisine yerleştirilmiş olan EKG ve sıcaklık izleme cihazlarıyla daha iyi temas sağlamak amacıyla, gerekirse göğüs bölgesindeki tüyler nare gibi bir tüy temizleyici kullanılarak alınabilir. Ayrıca, kurumayı önlemek için gözlere tears natural PMM gibi bir ISV uygulayın ve deri altı enjeksiyon yoluyla yaklaşık 0.3 milliliters salin uygulayın.

Hayvanları hidrate etmek için. Şimdi fareleri, gömülü EKG solunum ve sıcaklık probları bulunan bireysel kızaklara yerleştirin. Ön ve arka ekstremiteleri kızaklarda bulunan boşluklara yerleştirirken dikkatli olun.

EKG izlemesinin gerekli olduğu durumlarda, farenin karın bölgesindeki tüysüz alanların EKG problarıyla hizalandığından emin olun, her hayvanı bir baş kayışı ve burun kayışı ile sabitleyin ve ardından her kızağı açık uçlu 50 milliliter konik tüpe yerleştirin. Tek bir görüntüleme oturumunda yedi canlı fareye kadar tarama için hazırlık yapılabilir. Ardından, konik tüpleri yükleme dizisine monte edin.

Tüm hayvanlar yüklendikten sonra tüm fizyolojik izleme hatlarının bağlandığından emin olun. Mıknatıs boşluğundaki isofloran seviyesini %2'ye ve oksijen seviyesini dakikada sekiz litreye ayarlayın. Şimdi yükleme dizisini mıknatısa taşıyın ve ray sistemi üzerine yerleştirin.

Yükleme dizisini, fareleri mıknatıs boşluğunun merkezinde yer alan her bir radyo frekans bobininin içine tekdüze şekilde konumlandırmak için tasarlanmış olan fare kovanına bağlamak için ray sistemini kullanın. Mıknatısa tamamen yerleştirildiğinde, santrifüj tüpleri burada görüldüğü gibi RF bobinleri içindeki anestezik uygulama sistemine kenetlenir; oksijenle karıştırılmış ISOF flor, fare kovanından her bir bobinin ekseni boyunca uzanan bir tüp aracılığıyla örneğe iletilir. Bu anestezik gaz karışımı tüplerin içinden fareleri geçerek akar ve yükleme dizisinin arkasına bağlı aktif bir tahliye ünitesi tarafından toplanır.

Hayvanların solunum ve vücut sıcaklığı gibi fizyolojik okumalarına bağlı olarak, izofluran seviyeleri %0,9 ile %2 arasında ayarlanmalıdır. Şimdi, hızlı bin echo dizisi kullanarak hayvanları tarayın. Her bir üç boyutlu taramanın süresi yaklaşık üç saattir ve sonuçta 125 mikrometre görüntü çözünürlüğü elde edilir. Tarama süreci boyunca her hayvanda EKG okumalarını, solunumu ve vücut sıcaklığını izlediğinizden emin olun.

Hayvanlar, tarama oturumu sırasında ısıtılmış hava akışıyla sıcak tutulmalıdır. Tarama tamamlandığında, yükleme dizisini mıknatıstan çıkarın ve %100 oksijenle doldurulmuş sıcak bir indüksiyon odasına yerleştirin. Hayvanları tüplerden çıkarın ve biyolojik güvenlik kabinine taşınmak üzere plastik sızdırmaz kaplara aktarın.

Son olarak, hayvanları hava akımından uzak, sıcak bir kafese yerleştirin ve exvivo hayvan görüntüleme için anesteziden uyanmalarını bekleyin. Öncelikle, ketamin ve ksilazin kombinasyonunun intraperitonal enjeksiyonu ile hayvanları tam olarak anesteziye alın. Perfüzyona başlamadan önce, ayak parmağı veya pençe sıkıştırma yöntemiyle cerrahi anestezi düzeyini değerlendirin.

Göğüs boşluğunu açın ve kalbin sol ventrikülüne bir iğne veya güvenli kanatlı infüzyon seti yerleştirin. Ardından, transkardiyak perfüzyona başlamak için sağ aurikülü kesin. İlk olarak, yaklaşık 100 ml/saat akış hızını kullanarak, mililitre başına 1 µL heparin ve 2 mM pronase ile karıştırılmış 30 ml oda sıcaklığında 1x fosfat tamponlu salin ile yıkama yapın.

Bu işlem yaklaşık 20 dakika sürmelidir. Bir sonraki fiksasyon aşaması için, iki millimolar pro hands ile karıştırılmış oda sıcaklığındaki 30 mililitre %4 paraform aldehit çözeltisini saatte 100 mililitre hızla uygulayın. Şimdi hayvanın başını kesin; deriyi, alt çeneyi, kulakları ve burun ucundaki kıkırdak dokuyu çıkarın.

Ardından, kalan kafatası yapısını iki milimolar pro hands ile karıştırılmış %4 paraformaldehide yerleştirin ve dört derece Celsius'ta gece boyunca bekletin. Ertesi gün, örneği koruma amacıyla iki milimolar pro hands ve %0,02 sodyum azid ile karıştırılmış 1x fosfat tamponlu salin çözeltisine aktarın. Yedi Tesla'da yüksek çözünürlüklü üç boyutlu MRI taraması en az dört gün içinde, ancak iki buçuk aydan daha uzun sürmeden gerçekleştirilmelidir.

Perfüzyondan sonra, görüntüleri alınacak beyinleri 16 kanallı bir solenoid bobin dizisine yerleştirin ve bunu tarayıcıya yerleştirin. Ardından, örnekleri hızlı spin ekosu sekansı kullanarak tarayın.

Bu tarama süresi yaklaşık 12 saattir ve final görüntüleri 32 mikrometre izotropik çözünürlüğe sahip olacaktır. Tarama tamamlandıktan sonra örnekleri görüntüleme bobininden çıkarın ve her kafatasını, in vivo temsili koruma için iki milimolar pro hands içeren %10'luk formalin çözeltisine yerleştirin. Bir adet üç saatlik taramadan elde edilen çok sayıda fare beyni görüntüsü burada gösterilmiştir.

Bu şekil, taranan yedi farenin her biri için üç görüntüleme eksenini göstermektedir. Burada, 32 mikron izotropik çözünürlükte temsilci bir ex vivo beyin görüntüsü yer almaktadır. Ve burada, işleme alındıktan sonra bir ex vivo görüntü hacminin 3B oluşturmasını görebiliriz.

Bu in vivo teknik, doğru şekilde uygulandığında üç ila dört saat içinde tamamlanabilir. Bu teknik, biyomedikal alanlardaki birçok araştırmacı tarafından fare modelinde lupus, Huntington ve Alzheimer hastalıkları gibi hastalıkları incelemek için kullanılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, yüksek kaliteli beyin görüntüleri elde etmek için MRI kullanarak hem canlı hem de fikse edilmiş deneklerin nasıl görüntüleneceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

İzlediğiniz için teşekkürler.