Name: Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-25T16:03:00.000+00:00
Duration: 11 min 19 s
Description: Öğrenin peptidil-tRNA içeren çeviri ribozomlarını izole etme yöntemini. Biyotin etiketli mRNA ve streptavidin manyetik boncuklar kullanılarak fonksiyonel ve yapısal analizler yapılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

LRC-V. Bu çalışmada, sayıları bir öncelik her zaman öğrencilerin eğitim harika bir Profesör Dr. Adriel D. Johnson bellek adamak istiyor. Biz, Adriel sizi özledim. Biz bu çalışmada açıklanan deneyler ona yardım için Jacqueline Moreno minnettarız. Bu çalışma, Ulusal Bilim Vakfı, MCB-0615390 CY sağlanan hibe tarafından desteklenen ve LRC-V verilen start-up fonları tarafından. Huntsville Alabama Üniversitesi.

1. Hücre Ücretsiz Özü hazırlanması. <ol><li> İki pelet bakteriyel bir kuru Escherichia coli gram orta-log faz kültürler tampon yarım litre ile iki kez yıkanır elde edilen A içeren 10 mM Tris-asetat, pH 8.0, 14 mM magnezyum asetat, 60 mM potasyum asetat ve 50 mg 5000 X g de 5 dakika santrifüj 4 / ml phenylmethanesulphonylfluoride (PMSF) ° C Yıkadıktan sonra, bakteriyel pelet tampon A. 40 mL yeniden süspanse </li><li> Bakteri hücrelerinin 6000 psi basınç uygulayarak, bir Fransız Basın kullanarak etkileniriz. Bu basınç, 600 adet bir-inç piston kullanarak karşılık gelir. Kesintiye süspansiyon temiz bir cam tüp (50 ml) toplanır. </li><li> Kesintiye süspansiyon 1 mM dithiotreitol (DTT) ile tedavi edilir ve 30 dakika 30.000 xg'de santrifüj. Meydana gelen supernatant kullanarak, santrifüj işlemi tekrarlanır. Son süpernatant mikrotüpler (1 ml) sürülür. Son olarak, alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen kullanılarak dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C </li></ol> 2. RF2, Tüketilmiş Hücre ayıklar hazırlanması. <ol><li> Protein A sepharose 4B bulamaç boncuk 4,5 ml 5 ml, bir saat, oda sıcaklığında dönen bir tekerlek kullanarak bir anti-RF2 anti-serum ile karıştırılır. Karışımı antiserum boncuklar ayrı xg 2500 santrifüj edilir. Süpernatantı atılması üzerine, anti-RF2 antikorları (anti-RF2 boncuk) içeren bu boncukları daha sonra 1 ml 35 mM içeren tampon B tabanda tarafından yıkanır Tris-asetat, pH 7.8, 10 mM magnezyum asetat, 30 mM amonyum asetat, 60 mM potasyum glutamat ve 5 mg / ml leupeptin proteinaz inhibitörüdür. Anti-RF2 boncuk sonra santrifüj kullanarak aynı koşullar yukarıda belirtilen tampon B ayrılır. Yıkama işlemi iki kez tekrarlanır. </li><li> Bir mL hücre özü 4, dönen bir tekerlek kullanarak anti-RF2 boncuk 150 mcL ile karıştırılır ° C, iki saat boyunca. Karışımı boncuklar hücre özü ayrı 10.000 xg'de santrifüj edilir. Süpernatant 150 mcL başka bir anti-RF2 boncuk ile tekrar kaldırılır ve tedavi edilir. Bu prosedür ortaya çıkan hücre özü çözümü ile bir kez daha tekrarlanır. Son hücre ekstresi solüsyonu (100 mcL) mikrotüpler içine dağıtılır. Alikotları, kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen ile dondurulur ve -60 saklanır ° C veya -80 ° C </li></ol> 3. DNA Şablon hazırlanması. <ol><li> Şekil 1, her dNTP 0.2 mikromolden ve 50 U belirtilen oligodeoxynucleotides her birinin 0.4 nanomol ile karıştırma 600 femtomoles dizileri tercüme içeren plazmid şablonu (Şekil 1) 1 ml PCR reaksiyon hazırlayın Taq- Stratagene A.Ş. tarafından verilen tampon DNA polimeraz amplifikasyon reaksiyon aşağıdaki koşullar altında gerçekleştirin: 94 ° C, 2 dakika süreyle (94 ° C - 30 s, 55 ° C - 30 s, 72 ° C 1 dakika için; 30 siklus) ve 72 ° C 12 dak. </li><li> 1 / 10, 3 M sodyum asetat hacmi, pH 5.2 ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt ekleyerek DNA presipite PCR ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. Dietil-pyrocarbonate (DEPC) tedavi su 100 mcL DNA tekrar Tipik olarak, bu yordamı 100 mikrogram 600 bp DNA ürün verir. </li><li> PCR ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın. </li></ol> 4. Biotin Etiketli mRNA hazırlanması. <ol><li> 5 mikrogram, ATP, CTP, GTP, UTP 0,3 mikromolden, biotin-16-UTP 50 nanomol, ve 10 mcL 0.5 mikromolden ile oluşturulan PCR-DNA parçasının karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro transkripsiyon reaksiyon 100 mcL hazırlayın Promega A.Ş. tarafından verilen tampon T7 enzim karışımı reaksiyon karışımı 37 ° C'de 3 saat. Elde edilen mRNA miktarını ölçmek için, DNA şablonu RNaz-ücretsiz DNaz ekleyerek ortadan kaldırılmalıdır. 37 ° reaksiyon ° C 'de 10 dakika inkübe edin. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2 ve 2 cilt soğuk etanol eklenerek RNA presipite mRNA ürünleri arındırın. Yağış prosedürü bir kez daha tekrarlayın. DEPC tedavi su 100 mcL mRNA tekrar Genellikle, 600 nt biotin 1-2 mg arasında bu usul verimleri mRNA ürün olarak nitelendirdi. </li><li> Biotin etiketli mRNA ürünleri agaroz jel elektroforezi ile bütünlüğünü doğrulayın. </li></ol> 5. Çeviri Ribozomlar İçeren Peptidil-tRNA izolasyonu. <ol><li> 75 nanomol her on dokuz amino asit-radyoaktif bir amino asit, amino asit dışında yerini olacağını 10-15 mikrogram biotin etiketli mRNA karıştırma DEPC arıtılmış su in vitro çeviri reaksiyon karışımı bir 500 mcL hazırlayın , radyoaktif bir amino asit (37MBq) μCi, 50 ve 20-5 0, 40 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat, 2 mM DTT, 2 mM ATP, 0.5 içeren bir tampon reaksiyon karışımı RF2-tükenmiş hücre özü, mcL GTP mM, 30 mM fosfoenolpiruvat (KEP), 0.3 U / mL pirüvat kinaz (PK),% 3.5 polietilen glikol 8000, 1 mM spermidin, 20 mcg / mL folinik asit ve 250 mg / ml tRNA ( E.) coli. Reaksiyon karışımı 37 ° C'de 10 dakika. Reaksiyon bileşenlerinin yanı sıra sırası çok önemlidir. Hücre özü, amino asitler ve ribozomların aktivasyon izin oda sıcaklığında 5 dakika inkübe son karışımı içeren tampon çözelti ile karıştırılmalıdır. Daha sonra, biotin etiketli mRNA'ların eklenir. Kimyasal modifikasyonu prosedürleri kullanarak yapısal analizler için, radyoaktif bir amino asit eklenmesi gerekli değildir. </li><li> - Çeviri Reaksiyon karışımı içeren 35 mM Tris-asetat, pH 8.0, 10 mM magnezyum asetat, 175 mM potasyum asetat, 10 mM amonyum asetat ve 1 mM DTT tampon C askıya streptavidin paramanyetik boncuk (SMB), 3 mL ekle. Yeni süspansiyon oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> Manyetik ayırma standları kullanarak bir manyetik alan (MF) uygulayarak karışımı SMB ayırın. </li><li> Tampon C SMB yeniden süspanse ve MF kullanarak tekrar boncuklar ayrı. Bu yıkama işlemi iki kez tekrarlayın. Tampon C 500 mcL boncuk süspanse edin, buz süspansiyon saklamak ve hemen sonraki yordamı gerçekleştirmek. </li></ol> 6. İzole Ribozomlar Peptidil-tRNA İçeren Analizi. Peptidil-tRNA için <ol><li> 50 mM Tris-HCl, pH 6.8,% 2.5 (v / v) gliserol,% 4 sodyum dodesil sülfat, 2 mM DTT ve 0.2 mg içeren bir yükleme tamponu 10 mcL SMB 10 mcL Mix (tampon C askıya) / ml Bromophenol Mavi. Örneklerin% 10 Tris-tricine poliakrilamid jeller çalıştırarak boncuklar bağlı bileşenleri giderin. </li><li> Jeller bir vakum jel kurutma makinesi ile kurutun. </li><li> X-ray film kurutulmuş jel açığa peptidil-tRNA bütünlüğünü ve saflaştırma olun. </li></ol> Ribozomal RNA <ol start="4"><li> DEPC arıtılmış su ile hazırlanan 2 mM ethylenediaminetetraacetate (EDTA) solüsyonu 190 mcL ve 10 mcL boncuk süspansiyonu, su ile fenol dengelenmiş 200 mcL ekleyin. Dinç vorteks süspansiyon karıştırın ve oda sıcaklığında 3 dakika 10.000 xg'de santrifüj organik faz inorganik faz ayrı. Yeni bir mikrotüp üst su tabakası toplayın. </li><li> 1 / 10 hacim 3 M sodyum asetat, pH 5.2, 20 mg / ml, glikojen çözüm ve buz gibi soğuk etanol 2 cilt 1 mcL ekleyerek su tabakası RNA çöktürün. RNA 10 mcL DEPC arıtılmış su tekrar </li><li> Agaroz jel elektroforezi ile ribozomal RNA'lar bütünlüğünü doğrulayın. Genellikle, boncuk süspansiyon 50 mcL ribozomal RNA 1μg verir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 2 özetlenen yordamı kullanarak izole tercüme ribozomların kalite ve işlevsellik değerlendirilmesi analizler bir dizi sonuçlarını göstermektedir. Poliakrilamid jeller çözülmesi eşsiz bir grup gözlem SMB (Şekil 2A) bağlı biotin etiketli mRNA'ların bağlı polipeptidlerin varlığını gösterir. Bu yordamı kullanarak arıtma ribozomal RNA'lar ribozomların yanı sıra, bu biotin etiketli mRNA'ların bağlı (Şekil 2B) varlığı kurar. Puromycin Buna ek olarak, bir antibiyotik ribozom peptidil-transferaz aktivitesine yol, doğmakta olan peptidil tRNAs 1 bölünme. Bu bir değişim (Şekil 2C) poliakrilamid jeller izole polipeptid göç desen olarak görülmektedir. Birlikte, bu veriler SMB 'ye bağlı biotin etiketli mRNA'ların peptidil-tRNAs ile fonksiyonel ribozomlar içerdiğini göstermektedir. Ribozom fonksiyonu (Şekil 3A), özel peptidil tRNAs içeren tercüme ribozomların izolasyon peptidil-tRNAs, antibiyotik ve diğer moleküllerin etkilerini çalışma izinleri, ribozom yapısı (Şekil 3B). Antibiyotik sparsomycin burada örnekler sundu ve amino asit olan triptofan (Trp) izole ribozomlar (Şekil 3A) RF2 doğmakta olan tnaC-tRNA peptidil-tRNA indüklenen hidrolitik bölünme inhibe. Ribozom sparsomycin veya Trp etkileşim de tercüme Ribozom (Şekil 3B) 23S rRNA oluşturan bazı nükleotidlerin yapısal değişikliklere neden olur. Özetle, prosedür kullanılarak elde edilen biyolojik materyalin moleküler çeşitli faktörler ile etkileşimi üzerine ribozom fonksiyonu inhibisyonu dahil yapısal temas ek anlayış elde edilmesinde yararlı Burada anlatılan. ove_content "&gt; <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 peptidil-tRNAs içeren tercüme ribozomlar üretmek ve arındırmak için kullanılır Usul. DNA parçalarının ca. Şekilde gösterildiği tnaC gen ve bitişik bölge, içeren, uzunluğu 650 bp, biotin, [(biyo) UMP] mRNA içeren mRNA'ların hazırlanıyor şablon olarak kullanılır . Bu DNA parçalarının rakamın üstündeki belirtilen oligodeoxynucleotides kullanarak PCR prosedürleri ile üretilmektedir. Altı çizili harf nükleotid astar olarak kodlanmış T7 organizatörü yerini işaretleyin. Kalın harfler tnaC mRNA dizilerinin çeviri kullanılan Parlatıcı Dalgarno dizisi göstermektedir. DNA parçası T7 organizatörü tnaC sırası ve kodlama sırası downstream yazıya (ok) için kullanılır T7 RNA polimeraz tarafından kabul edilmektedir. RNA polimeraz rpoBC terminatör dizileri (rpoBC "t") sonra, DNA parçasının 3'-sonuna ulaştığında Transkripsiyon sonlandırıldı. RpoBC terminatör kök döngü yapısı, in vitro çeviri reaksiyonlarda kullanılan hücre ücretsiz özleri 3'-5 'exoribonuclease aktivite mevcut mRNA korur. Izole [(biyo) UMP] mRNA'ların in vitro çeviri deneyleri kullanarak durdu, tercüme ribozomlar oluşturmak için kullanılır . TnaC dizisi [(biyo) UMP] mRNA reaksiyon karışımının Release Faktörü yokluğu (RF2) nedeniyle son amino asit dahil edildiğinde duraklarına bir ribozom tarafından tercüme edilir. Ribozom [(biyo) UMP] mRNA kompleksleri mRNA dahil biotin etiketli nükleotidler bağlayan streptavidin manyetik boncuk (SMB) kullanarak toplam reaksiyon karışımından izole edilmiştir. KOBİ'ler bağlı ribozom-[(biyo) UMP] mRNA kompleksleri, bir manyetik alanı (MF) kullanarak toplam reaksiyon karışımı elde edilir. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 izole komplekslerinin yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) in vitro çeviri reaksiyonlar ile yapıldı [(biyo) UMP] mRNA'ların tnaC genin başlangıç ​​kodon bir stop kodon tarafından değiştirildi. Nihai ürünler Şekil 1'de belirtildiği gibi, streptavidin boncuk kullanılarak izole edildi. Reaksiyon ürünleri ve izole moleküller sonra poliakrilamid jeller elektroforezi ile analiz edildi. TnaC-tRNA ve tnaC peptid bantları işaretlenmiştir. B) Toplam RNA fenol çıkarma prosedürleri kullanarak durdu kompleksleri izole edilmiştir. Her izole RNA agaroz jel elektroforezi ile çözüldü. Ribozomal RNA (rRNA) gösterilir. C) tnaC-tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) ya da inkübe edildi (-) 10 dakika oda sıcaklığında 0.02 mM puromycin (Puro). TnaC peptid [35S]-metionin (A) veya [3H]-prolin (B) kullanarak çeviri sırasında etiketli. <img src="/files/ftp_upload/2498/2498fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3 antibiyotik sparsomycin veya amino asit olan triptofan bağlı ribozomlar tnaC-tRNA içeren yapısal ve fonksiyonel analizleri. A) tnaC tRNAs içeren İzole kompleksleri ile (+) veya (olmadan inkübe edildi -) sparsomycin (Spar) veya 5 dakika süreyle oda sıcaklığında triptofan (Trp). Daha sonra, karışım RF2 ile karıştırılır ve 37 ° C'de 20 dakika inkübe edildi. B) 23S rRNA metilasyon değişikliklerini analizi ribozom içinde bağlayıcı molekülleri tarafından uyarılan. İzole kompleksleri ile (+) ya da önceden inkübe edildi (-) 2 5 dakika boyunca 37 mM Trp veya Spar ° C Sonra bir alkilleme ajan, dimetil sülfat, eklenir ve karışım ilave bir 20 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Total RNA ekstrakte edildi ve astar uzantısı deneyleri [32P] değiştirilmiş nükleotid downstream 100 nükleotidler aralıklı 23S rRNA nükleotidler tamamlayıcı etiketli oligodeoxynucleotide ile yapıldı. Uzatma testlerinin son ürünleri poliakrilamid jel elektroforezi tarafından çözüldü. Trp veya Spar varlığı ile etkilenen 23S rRNA nükleotidler gösterilir.

<ol><li>Cruz-Vera, L. R., Gong, M., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+produced+by+bound+tryptophan+in+the+ribosome+peptidyl+transferase+center+in+response+to+tnaC%2C+a+nascent+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Changes produced by bound tryptophan in the ribosome peptidyl transferase center in response to tnaC, a nascent leader peptide.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 3598-3603 (2006).</li>
<li>Garza-Ramos, G., Xiong, L., Zhong, P., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+macrolide+antibiotics+on+the+ribosome%3A+new+resistance+mutation+identifies+a+specific+interaction+of+ketolides+with+rRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Binding site of macrolide antibiotics on the ribosome: new resistance mutation identifies a specific interaction of ketolides with rRNA.</a> J. Bacteriol. 183, 6898-6907 (2001).</li>
<li>Gaynor, M., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrolide+antibiotics%3A+binding+site%2C+mechanism+of+action%2C+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Top.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macrolide antibiotics: binding site, mechanism of action, resistance.</a> Curr. Top. Med. Chem. 3, 949-961 (2003).</li>
<li>Polacek, N., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+peptidyl+transferase+center%3A+structure%2C+function%2C+evolution%2C+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Crit.+Rev.+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ribosomal peptidyl transferase center: structure, function, evolution, inhibition.</a> Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 40, 285-311 (2005).</li>
<li>Steitz, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+the+functions+of+the+large+ribosomal+subunit%2C+a+major+antibiotic+target%5BTitle%5D)+AND+%22Keio+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Structural insights into the functions of the large ribosomal subunit, a major antibiotic target.</a> Keio J. Med. 57, 1-14 (2008).</li>
<li>Tenson, T., Mankin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+and+the+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Antibiotics and the ribosome.</a> Mol. Microbiol. 59, 1664-1677 (2006).</li>
<li>Xiong, L., Korkhin, Y., Mankin, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+site+of+the+bridged+macrolides+in+the+Escherichia+coli+ribosome%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrob+Agents+Chemother%22%5BJournal%5D)">Binding site of the bridged macrolides in the Escherichia coli ribosome.</a> Antimicrob Agents Chemother. 49, 281-288 (2005).</li>
<li>Child, S. J., Miller, M. K., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translational+control+by+an+upstream+open+reading+frame+in+the+HER-2%2Fneu+transcript%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Translational control by an upstream open reading frame in the HER-2/neu transcript.</a> J. Biol. Chem. 274, 24335-24441 (1999).</li>
<li>Fang, P., Spevak, C. C., Wu, C., Sachs, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nascent+polypeptide+domain+that+can+regulate+translation+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">A nascent polypeptide domain that can regulate translation elongation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 4059-4064 (2004).</li>
<li>Janzen, D. M., Frolova, L., Geballe, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+termination+mediated+by+an+interaction+of+eukaryotic+release+factor+1+with+a+nascent+peptidyl-tRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation termination mediated by an interaction of eukaryotic release factor 1 with a nascent peptidyl-tRNA.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 8562-8570 (2002).</li>
<li>Nakatogawa, H., Ito, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ribosomal+exit+tunnel+functions+as+a+discriminating+gate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The ribosomal exit tunnel functions as a discriminating gate.</a> Cell. 108, 629-636 (2002).</li>
<li>Onouchi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nascent+peptide-mediated+translation+elongation+arrest+coupled+with+mRNA+degradation+in+the+CGS1+gene+of+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Nascent peptide-mediated translation elongation arrest coupled with mRNA degradation in the CGS1 gene of Arabidopsis.</a> Genes Dev. 19, 1799-1810 (2005).</li>
<li>Raney, A., Law, G. L., Mize, G. J., Morris, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulated+translation+termination+at+the+upstream+open+reading+frame+in+s-adenosylmethionine+decarboxylase+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Regulated translation termination at the upstream open reading frame in s-adenosylmethionine decarboxylase mRNA.</a> J. Biol. Chem. 277, 5988-5994 (2002).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Rajagopal, S., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+ribosome-peptidyl-tRNA+interactions+essential+for+tryptophan+induction+of+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Features of ribosome-peptidyl-tRNA interactions essential for tryptophan induction of tna operon expression.</a> Mol. Cell. 19, 333-343 (2005).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+Residues+Asp16+and+Pro24+of+tnaC-tRNAPro+Participate+in+Tryptophan+Induction+of+tna+Operon+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Conserved Residues Asp16 and Pro24 of tnaC-tRNAPro Participate in Tryptophan Induction of tna Operon Expression.</a> J. Bacteriol. 190, 4791-4797 (2008).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., Yang, R., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryptophan+inhibits+Proteus+vulgaris+tnaC+leader+peptide+elongation%2C+activating+tna+operon+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Tryptophan inhibits Proteus vulgaris tnaC leader peptide elongation, activating tna operon expression.</a> J Bacteriol. 191, 7001-7006 (2009).</li>
<li>Cruz-Vera, L. R., New, A., Squires, C., Yanofsky, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosomal+features+essential+for+tna+operon+induction%3A+tryptophan+binding+at+the+peptidyl+transferase+center%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Ribosomal features essential for tna operon induction: tryptophan binding at the peptidyl transferase center.</a> J. Bacteriol. 189, 3140-3146 (2007).</li>
<li>Shimizu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+translation+reconstituted+with+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cell-free translation reconstituted with purified components.</a> Nat. Biotechnol. 19, 751-755 (2001).</li>
<li>Kinoshita, Y., Nishigaki, K., Husimi, Y. F. luorescence- <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((isotope-+or+biotin-labeling+of+the+5+%27-end+of+single-stranded+DNA%2FRNA+using+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">isotope- or biotin-labeling of the 5 '-end of single-stranded DNA/RNA using T4 RNA ligase.</a> Nucleic Acids Res. 25, 3747-3748 (1997).</li>
<li>Nishigaki, K., Taguchi, K., Kinoshita, Y., Aita, T., Husimi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Y-ligation%3A+an+efficient+method+for+ligating+single-stranded+DNAs+and+RNAs+with+T4+RNA+ligase%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Divers%22%5BJournal%5D)">Y-ligation: an efficient method for ligating single-stranded DNAs and RNAs with T4 RNA ligase.</a> Mol Divers. 4, 187-190 (1998).</li>
</ol>

Bu raporda açıklanan Bu izolasyon prosedürü yeniden üretilebilir niteliktedir. Ne yazık ki, aynı tercüme dizileri üretilen kısa peptidil-tRNAs varlığı uygun kaçınılmalıdır; böyle peptidil-tRNAs toplam izole malzeme (Şekil 2C)% 15-20 oranında karşılık gelebilir. Bu kirleticiler, biotin etiketli mRNA yüksek konsantrasyonlarda kullanılan ya da kullanılan hücre özü, eski ya da birkaç kez tekrar edilmiştir konsantrasyon artırabilir. Bu nedenle, in vitro çeviri reaksiyonlarda bileşenleri kalite ve konsantrasyonunu kontrol etmek için çok önemlidir . Alternatif olarak, ticari yüksek verim sulandırılmış hücre özleri, aynı amaçlar (PURE sistemi) 18 için kullanılabilir mevcuttur . Bu yöntemi kullanarak, biotin-16-UMP rastgele hedef mRNA uzunluğu boyunca kurulmuştur. Üridin yolları içeren bazı Orfs kendi çeviri etkileyen, dizileri nükleotid değiştirilmiş dahil olabilir olasılığı vardır. Biotin-16-UTP/UTP değişken, göreceli konsantrasyonların mRNA sentezi sırasında en etkili çeviri elde etmek için test edilmesi gerekir. MRNA&#39;ların 5&#39;-sonunda, en istikrarlı sonuna hedefleyen, biotin etiketleme alternatif yöntemler kullanılabilir. (I) Biotin, 3&#39;-NH2ATP (3&#39;-amino, 3&#39;-deoksiadenozin trifosfat) ve T4 RNA ligaz 19 mRNA 5&#39;-end eklenebilir . (Ii) 5&#39;-biotin-etiketli oligonükleotid yanı sıra 20 T4 RNA ligaz kullanarak mRNA&#39;nın 5&#39;-sonuna kadar eklenebilir. (Iii) mRNA&#39;nın 5&#39;-sonunda tamamlayıcı dizisine karşılık 3&#39;-ucundaki biotin etiketli oligodeoxynucleotides tercüme kompleksleri da izole etmek için kullanılır olabilir. Bu biotin etiketli oligodeoxynucleotides izolasyon önce SMB bağlı olabilir. Daha sonra onların tamamlayıcı mRNA dizileri ile etkileşime olanak çeviri reaksiyon karışımı ile SMB karışık olabilir biotin etiketli oligodeoxynucleotides bağlı. Izolasyondan sonra melez RNA-DNA bölge ve bölge biotin etiketli oligodeoxynucleotide ve mRNA dizisi arasındaki literatürde - RNAse H kullanarak bozulmuş olabilir, streptavidin boncuk durdu kompleksleri ayıran. Bu alternatif yöntem, kompleksleri, yüksek çözünürlüklü yöntemler kullanılarak geleceğe yönelik yapısal analizlerde istihdam edilmek üzere izin verebilir.

<table><tbody><tr><td>Tris baz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum asetat</td><td>Fluka</td><td>63049</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum glutamat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>Amonyum asetat</td><td>Fluka</td><td>09688</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Protein A sefaroz 4B süspansiyon boncukları</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9424</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin inhibitörü</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L9783</td><td></td></tr><tr><td>Taq-DNA polimeraz</td><td>Stratagene, Agilent Technologies</td><td>201223</td><td></td></tr><tr><td>T7 Maxiprep kiti</td><td>Promega Corp.</td><td>P1300</td><td></td></tr><tr><td>SMB</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5482</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-16-UTP</td><td>Roche Group</td><td>1388908</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8877</td><td></td></tr><tr><td>PEP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7002</td><td></td></tr><tr><td>PK</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7768</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenglikol 8000</td><td>Fluka</td><td>81268</td><td></td></tr><tr><td>Folinik asit</td><td>Fluka</td><td>47612</td><td></td></tr><tr><td>Spermidin</td><td>Fluka</td><td>85558</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; kaynaklı tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>DEPC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5758</td><td></td></tr><tr><td>Trisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5816</td><td></td></tr><tr><td>L-amino asitler</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Fluka</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>manyetik ayırma standları</td><td>Promega Corp.</td><td>Z5342</td><td></td></tr></tbody></table>

fonksiyonel ve yapısal analizler için peptidil trnas İçeren Çeviri ribozomlar izolasyonu

Isolation of Translating Ribosomes Containing Peptidyl-tRNAs for Functional and Structural Analyses

Son zamanlarda, yapısal ve biyokimyasal çalışmalarda birçok ribozom antibiyotikler ile protein sentezi inhibisyonu sırasında ve doğmakta olan polipeptid sentezi sırasında meydana gelen moleküler olayların detaylı var. Bazı antibiyotikler, ve çoğunlukla peptidil-tRNAs formu düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin, peptid bağı oluşumu veya çeviri fesih 1-7 inhibe ederler. Bu inhibitör olaylar ribozom hareketi durdurmak, bir fenomen &quot;translasyon tutuklama&quot; olarak nitelendirdi. Bir antibiyotik ya da olgunlaşmamış bir polipeptid ya indüklenen Çeviri tutuklanması, hücre büyümesi, antibiyotik direnci, protein translokasyon ve hücre metabolizması 8-13 gibi çeşitli hücresel fonksiyonları yer alan genlerin ifade düzenleyen gösterilmiştir. Biz her organizma çeviri ribozom tam rolü, anlamak istiyorsak, antibiyotik ve düzenleyici doğmakta olan polipeptidlerin ribozom fonksiyonu nasıl değiştirdiğini Bilgi esastır. Burada, biz, sadece arındırmak analiz için, bu ribozom belirli bir mRNA&#39;nın çeviri ve belirli bir peptidil-tRNA 14 içeren kullanılan basit bir metodoloji açıklanmaktadır. Bu prosedür, biotin etiketli mRNA bağlı ribozomlar tercüme selektif izolasyon dayanmaktadır. Bu translasyonel kompleksleri streptavidin paramanyetik boncuk (SMB) ve (MF) bir manyetik alan kullanarak, aynı karışımı diğer ribozom ayrılır. Biotin-etiketli mRNA&#39;ların T7 transkripsiyonel rehberleri içeren şablonları PCR oluşturulan DNA parçaları kullanarak run-off transkripsiyon analizleri ile birleşiyor. T7 RNA polimeraz biotin UTP biotin-16-UMP içeriyor; koşullar altında yaklaşık on biotin-16-UMP moleküllerinin% 25 UMP içeriği ile 600 nt mRNA dahil edilmiştir. Bu biotin etiketli mRNA&#39;ların sonra izole ve serbest faktör 2 (RF2) ile yapılan in vitro çeviri deneylerde kullanılan tükenmiş yabani türü veya mutant ribozom içeren Escherichia coli suşlarının elde edilen hücre özleri. Biotin etiketli mRNA dizileri çevirirken Ribozomlar, normalde çeviri fesih gerçekleştirir RF2 protein, olmaması nedeniyle, stop kodon bölgedeki sekteye uğruyor. Yeni sentezlenmiş peptidil-tRNA içeren durdu ribozomlar izole ve SMB ve MF kullanarak çeviri reaksiyonlar kaldırılır. Bu boncuklar sadece biotin içeren mesajlar bağlanır. Izole, translasyonel kompleksleri, vahşi tip ya da mutant ribozomal bileşenleri, veya peptidil-tRNA dizilerinin yanı sıra, antibiyotik veya diğer moleküler faktörler 1,14-16 ribozom etkileşim belirleyen yapısal ve fonksiyonel özelliklerini analiz etmek için kullanılabilir. Bu izole ribozom kompleksleri fonksiyonunu incelemek için, peptidil transferaz deneyleri, antibiyotik puromycin 1 varlığında yapılabilir . Translasyonel komplekslerinin yapısal değişiklikleri incelemek için, iyi kurulmuş prosedürler belirli amino asitleri 14 ve / veya ii) alkilleme koruma deneyleri 1,14,17) i olarak, crosslinking kullanılan olabilir.

Doğmakta olan peptidil-tRNAs içeren ribozomların biyokimyasal analizler için büyük bir engel, aynı örneklerde diğer ribozom varlığı olmuştur analiz edilen spesifik mRNA dizisinin çevirisinde yer almayan ribozomlar. Biz sadece ilgi doğmakta olan peptidil-tRNA içeren ribozomlar arındırmak için basit bir yöntem geliştirdi.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Son zamanlarda gerçekleştirilen yapısal ve biyokimyasal çalışmalar, protein sentezi inhibisyonu sırasında ribozomda meydana gelen birçok moleküler olayı detaylandırmıştır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, benzersiz bir peptid tRNA içeren saf ribozomların yapısını ve işlevini analiz etmektir. Bu işlem, biotin etiketli mRNA'lara bağlı duraklatılmış pep tRNA ribozom kompleksleri oluşturmak için, salınım faktörlerinden arındırılmış hücre dışı ekstraktlar ve biotin etiketli mRNA'lar ile in vitro translasyon analizleri gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci bir adım olarak, mRNA'da bulunan biotin molekülleriyle etkileşime girmelerini sağlamak amacıyla, streptavidin bağlı paramanyetik boncuklar in vitro translasyon analizleri ile karıştırılır.Daha sonra, toplam reaksiyondan mRNA'lara bağlı duraksamış peptid-tRNA ribozom komplekslerini çeken manyetik alanlar kullanılarak boncuklar ekstrakte edilir. Ardından, saflaştırılmış peptid-tRNA ribozom kompleksleri, fonksiyon analizleri yapmak amacıyla salınım faktörü translasyonu, inhibe edici antibiyotikler veya kimyasal modifikasyon ajanları gibi translasyonel faktörlerle karıştırılabilir. Ribozomun inhibisyonu ve yapısına ilişkin sonuçlar; peptid transferaz aktivitesi veya SDS veya Tris-Racine PAGE jelleri kullanılarak yapılan translasyonel terminasyon analizleri ile üre PAGE jelleri kullanılarak yapılan modifikasyon koruma analizlerine dayanarak, peptid-tRNA'ların hidrolizinin inhibisyonunu ve bunun ribozomlardaki yapısal değişikliklerle korelasyonunu göstermektedir.Bu tekniğin diferansiyel santrifüjasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izole edilen örneklerin çoğunlukla yalnızca tek bir pep tRNA popülasyonuna sahip ribozomlar içermesidir. Bu yöntem, yeni sentezlenen polipeptitlerin doğası ve antibiyotiklerin translasyon sürecini modüle etmek gibi ribozom fonksiyonunu nasıl etkilediği gibi gen ekspresyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, log fazı kültürlerinden iki gram kuru e coli bakteri peleti temin edin.Peleti bir litre tampon çözeltide yeniden süspanse ederek yıkayın ve ardından 4 °C'de beş dakika boyunca 5,000 Gs hızında santrifüjleyin. İki yıkama işlemi gerçekleştirdikten sonra, elde edilen bakteri peletini 40 mililitre tampon çözeltide yeniden süspanse edin ve 6,000 PSI basınç uygulayan bir French pres kullanarak bakteri hücrelerini parçalayın. Bu basınç, bir inçlik piston kullanıldığında 600 birime tekabül eder.Parçalanmış süspansiyonu 50 mililitrelik temiz bir cam tüpe toplayın. Parçalanmış süspansiyonu bir milimolar DIO triol veya DTT ile muamele edin ve örneği 30.000 Gs'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Oluşan süpernatantı uzaklaştırın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.İkinci santrifüjden elde edilen süpernatantı saklayın ve final süpernatantı mikrotüplere paylaştırın. Son olarak, alikotları kuru buz-etanol karışımı veya sıvı azot kullanarak hızlıca dondurun ve numuneleri -60 veya -80 °C'de saklayın.4,5 mililitre protein A spheros four B bulamaç boncuklarını beş mililitre anti RF two antiserumü ile karıştırarak RF two'dan arındırılmış hücre dışı ekstraktların hazırlığına başlayın. Karışımı oda sıcaklığında, döner bir çark üzerinde bir saat boyunca döndürün. Boncukları antiserumden ayırmak için karışımı 2.500 Gs'de santrifüjleyin.Süpernatantı atın. Boncuklar artık anti RF iki antikorlarını içermektedir ve bundan böyle anti RF iki boncukları olarak adlandırılacaktır. Boncukları bir mililitre tampon b içinde yeniden süspanse ederek yıkayın.Ardından, anti RF iki boncuklarını tampon B'den ayırmak için boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Boncukları yıkadıktan sonra, bir mililitre hücresiz ekstraktı 150 µL anti RF iki boncuğu ile karıştırın ve inkübasyonun ardından dört °C'de döner bir tekerlek üzerinde iki saat boyunca inkübe edin. Hücresiz ekstraktı boncuklardan ayırmak için karışımı 10,000 ×g'de santrifüjleyin.Süpernatantı uzaklaştırın ve inkübasyonu tekrarlayıp tekrar çöktürme işlemi yapmadan önce 150 µL daha anti RF iki boncuğu ile işleme tabi tutun. Nihai RF iki eksiltilmiş hücreden arındırılmış ekstrakt çözeltisini, tüp başına 100 µL olacak şekilde mikro tüplere paylaştırın. Alikotları kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve -60 veya -80 °C'de saklayın.Çevrilecek dizileri içeren plazmit kalıbı, oligo deoksiribonükleotidleri, dNTP'leri, sağlam DNA polimerazı ve stratejik PCR tamponunu birleştirerek PCR reaksiyonunu hazırlayın. PCR örneği hazırlandıktan sonra amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirin; PCR ürünlerini saflaştırmak için bir onda hacimce 3 molar sodyum asetat (pH 5.2) ve iki hacimce buz gibi soğuk etanol ekleyerek DNA'yı çöktürün. Çöktürme prosedürünü bir kez daha tekrarladıktan sonra, elde edilen DNA'yı 100 µL dietilperkarbonat veya DEPC ile işlem görmüş su içerisinde süspanse edin.PCR ürünlerinin bütünlüğünü agaroz jeller üzerinde elektroforez ile doğrulayın. Bu prosedür tipik olarak 600 baz çiftlik bir DNA ürününden 100 mikrogram elde edilmesini sağlar. Beş mikrogram PCR kaynaklı DNA fragmanını, biotin etiketli UTP ribonükleotidleri ve T7 enzim karışımı ile DEPC işlem görmüş su içerisinde karıştırarak 100 mikrolitrelik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın.Reaksiyon karışımını 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Elde edilen mRNA miktarını belirlemek için, RNA'sız DNaz ekleyerek DNA kalıbını ortadan kaldırın. Reaksiyonu 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.mRNA ürünlerini saflaştırmak için, bir onda hacimde üç molar sodyum asetat pH 5.2 ve iki hacim soğuk etanol ekleyerek RNA'yı iki kez çöktürün; çöken mRNA'yı 100 µL DEPC işlem görmüş su içinde yeniden süspanse edin. Biotin işaretli mRNA ürünlerinin bütünlüğünü agaroz jellerde elektroforez ile doğrulayın. Bu prosedür genellikle, peptid-tRNA içeren translasyon yapan ribozomların izolasyonuna başlamak için 600 nükleotitlik biotin işaretli mRNA ürününden bir ila iki miligram arasında verim sağlar. DEPC işlem görmüş su içerisinde 500 µL in vitro translasyon reaksiyon karışımı hazırlanır.Öncelikle, beraberindeki yazılı protokolde açıklanan tamponlu reaksiyon karışımını hazırlayın ve ardından, radyoaktif bir amino asit ile değiştirilecek olan dışındaki amino asitlerin her birinden 75 M ekleyin. Sonra, amino asitleri içeren tampon çözeltiye 20 ila 50 µL RF iki eksiltilmiş hücreden arındırılmış ekstrakt ekleyin. Ribozomların aktivasyonuna izin vermek için karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.Ribozomlar aktive edildikten sonra, numuneye 10 ila 15 µg biotin işaretli mRNA ekleyin. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.Bu sırada, tampon C içerisinde üç mililitre streptavidin paramanyetik boncuk veya SMB hazırlayın. İnkübasyonun ardından, SMP süspansiyonunu translasyon reaksiyon karışımına ekleyin. Yeni süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Manyetik ayırma standlarını kullanarak manyetik alan uygulayıp SMB'leri karışımdan ayırın. Yeniden süspSMB'yi tampon C içerisinde süspande edin ve manyetik stand kullanarak boncukları tekrar ayırın. Bu yıkama prosedürünü iki kez tekrarladıktan sonra, boncukları 500 µL tampon C içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu buz üzerinde saklayın ve bir sonraki prosedürü derhal gerçekleştirin. Peptid TRNA'yı görselleştirmek için, süspande edilmiş SMB ve tampon C'den 10 µL'yi 10 µL yükleme tamponu ile karıştırın; örnekleri %10 Tris tric poliakrilamid jellerde koşturarak boncuklara bağlı bileşenleri ayırın.Jelleri bir vakumlu jel kurutucu kullanarak kurutun. Ardından, kurutulmuş jeli bir röntgen filmine maruz bırakarak peptit TRNA'nın bütünlüğünü ve saflığını doğrulayın. Ribozomal RNA'yı analiz etmek için, dpci ile işlem görmüş su ile hazırlanmış 2 mM EDTA çözeltisinden 190 µL, suyla dengelenmiş fenolden 200 µL ve bir boncuk süspansiyonundan 10 µL birleştirin.Elde edilen süspansiyonu kuvvetli bir şekilde vorteksleyerek karıştırın. İnorganik fazı organik fazdan, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 10, 000 Gs'de santrifüj ederek ayırın; üstteki su tabakasını yeni bir mikrotüpe toplayın. Su tabakasındaki RNA'yı, hacmin onda biri kadar üç molar sodyum asetat pH 5.2, 1 µL 20 mg/mL glikojen çözeltisi ve iki hacim buz soğukluğunda etanol ekleyerek çöktürün. Çöken RNA'yı 10 µL DEPC işlem görmüş su içerisinde yeniden süspanse edin.Ribozomal RNA'ların bütünlüğünü niros jellerde elektroforez yaparak doğrulayın. Genellikle 50 µL boncuk süspansiyonu, bir µg ribozomal RNA sağlar. Burada, izole edilen translasyon yapan ribozomların kalitesini ve işlevselliğini değerlendiren bir dizi analizin sonuçları sunulmaktadır.Poliakrilamid jellerde çözünürlüğe kavuşmuş benzersiz bir bandın gözlemlenmesi, SMB'ye tutunmuş biotin işaretli mRNA'lara bağlı polipeptitlerin varlığını gösterir. Ribozomal RNA'ların saflaştırılması. Bu prosedürün kullanılması, bu biotin işaretli mRNA'lara bağlı ribozomların varlığını da kanıtlar.Ribozomun peptidil transferaz aktivitesini indükleyen bir antibiyotik olan purmisinin eklenmesi, yeni sentezlenen peptidil tRNA'ların kesilmesiyle sonuçlanır. Bu durum, poliakrilamid jellerde izole edilen polipeptidin migrasyon paternindeki bir kayma olarak gözlemlenir. Toplu olarak bu veriler, SMB'ye tutunmuş biotin işaretli mRNA'ların, peptidil tRNA'lar içeren fonksiyonel ribozomlar barındırdığını göstermektedir.Spesifik peptid tRNA'lar içeren translasyonel ribozomların izolasyonu; peptid tRNA'ların, antibiyotiklerin ve diğer moleküllerin ribozom fonksiyonu ve ribozom yapısı üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Burada sunulan örneklerde, parsamyn antibiyotiği ve triptofan amino asidi, izole ribozomlarda nascent TNAC tRNA peptid tRNA'nın RF two tarafından hidrolitik parçalanmasını inhibe etmektedir.Triptofan veya sparsomisinle olan etkileşim, translasyon yapan ribozomun 23S rRNA'sını oluşturan bazı nükleotidlerde de yapısal değişiklikler meydana getirir. Uzmanlaşıldığında, bu tekniğin ana kısmı, prosedürlerin doğru şekilde takip edilmesiyle beş saat içinde tamamlanabilir. Benzersiz protein ve RNA içeren ribozom yapısına dair ek soruları yanıtlamak için cryo-EM gibi diğer yapısal analiz yöntemleri de uygulanabilir.

isolation-translating-ribosomes-containing-peptidyl-trnas-for

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu makale, ökaryotik hücrelerde ribozom tercüme çıkarılması için bir protokol tanımlamaktadır. Bir kez çıkarılan, ribozom, farklı ribozomal popülasyonlar analiz izin vermek için sukroz gradient fraksiyonlandırmasıyla monosomes ve polyribosomes içine ayrılır. Gibi, bu yöntem çeviri düzenleme incelenmesi için altın standarttır.

Ökaryotik Polyribosome Profil Analizi

MRNA üzerindeki translasyonel duraklama siteleri tanımlamak için bir teknik tarif edilmiştir. Bu prosedür bir denatüre jel elektroforez ile olgunlaşmamış zincirlerinin boyutu analizi ve ardından bir hedef mRNA in vitro için, içerisinde sırasında ribozom üzerinde biriken olgunlaşmamış polipeptidlerin izolasyonu dayanmaktadır.

Ribozom Bağlı Doğan Polipeptitler İzolasyonu<em&gt; In vitro</em&gt; MRNA boyunca Translasyonel Duraklat Siteleri Belirleme

Biz burada artık rutin stabil bağlı ribozom doğmakta olan zincir kompleksleri (RNCs) izole etmek için kullanılan bir tekniği açıklar. Bu teknik bir 17 amino asit uzunluğunda SECM "tutuklama" dizisi bir prokaryotik çeviri uzama durdurmak olduğunu keşif yararlanır...

Ribozom Ciltli Polipeptitler izole bir aracı olarak SECM Tutuklanma sırası kullanılarak

Bu protokol, in vivo CNS numunelerin translatome incelemek amacıyla polyribosome fraksiyonasyon bölgesinin temel bir değişiklik göstermektedir. Bu, izolasyon ve bağlı RNA ribozom fraksiyonlarının toplam RNA ile karşılaştırılması, translasyon ve transkripsiyon düzenleme küresel değerlendirmesini sağlar.

Polyribosome Fraksiyonu tarafından Santral Sinir Sistemi Translatome in vivo sorguluyor

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Ribozomlar protein sentezinde önemli bir rol oynamaktadır. Sükroz yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile Polyribosome (Polizom) fraksiyonlara ayırma, bir genom geniş bir ölçekte tek mRNA translasyon etkinliklerine doğrudan belirlenmesini sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem, şaperonlar ve sinyal molekülleri gibi ribozom-ve Polizomdan ilişkili faktörleri biyokimyasal analizi için kullanılabilir.

Bir genom Ölçeği Polizom Fraksiyonu ve Memeli Translatomes Analizi

Ribozom Afinite Saflaştırması (TRAP) çevirisi, mRNA'nın hücre tipine özgü translasyonunu yakalayabilir. Burada, Drosophila embriyolarının nadir hücre popülasyonlarında mRNA'nın izolasyonuna adanmış ilk TRAP protokolünü rapor ediyoruz.

Nadir hücre popülasyonlarının gelen TUZAK-rc, Tercüme Ribozom Affinity Arıtma<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Canlı maya ve memeli hücrelerinde formaldehit çapraz bağlama ile çevirisel (protein biyosentez) kompleksleri hızla stabilize etmek için bir teknik sunuyoruz. Yaklaşım, geçici ara maddelerin ve dinamik RNA:protein etkileşimlerinin parçalanarak parçalanmasını sağlar. Çapraz bağlantılı kompleksler, derin sıralama tabanlı profil oluşturma yöntemleri, mikroskopi ve kütle spektrometresi gibi birden fazla aşağı akış uygulamasında kullanılabilir.

Ökaryotik Hücrelerden Çeviri Komplekslerinin Hızlı In Vivo Fiksasyonu ve İzolasyonu

Bu protokol, otomatik gradyan üreticileri veya gradyan fraksiyonasyon sistemleri kullanmadan bir çoklu profilin nasıl oluşturulacağını açıklar.

Degrade Yapıcılar veya Fraksiyonasyon Sistemleri Olmadan Polizom Profilleme

Ko-translasyonel etkileşimler, yeni zincir modifikasyonlarında, hedeflemede, katlamada ve montaj yollarında çok önemli bir rol oynamaktadır. Burada, ökaryot Saccharomyces cerevisiae modelinde bu etkileşimlerin in vivo, doğrudan analizi için bir yöntem olan Seçici Ribozom Profillemeyi açıklıyoruz.

Ko-Translasyonel Etkileşim Ağlarının Seçici Ribozom Profilleme ile Küresel Tanımlanması

AviTag-spesifik Konum Kısıtlı Aydınlatma Takviyeli Biyotinilasyon (ALIBi), ribozom popülasyonlarının etiketlenmesi ve afinite-affinite-arındırıcı olarak arındırılması amacıyla geliştirilen, sonraki dizileme ve proteomik analiz için geliştirilen yeni bir optogenetik olarak aktive edilmiş yöntemdir.

Rekombinant Peptit Etiketine Özgü Konum Kısıtlı Aydınlatma Güçlendirilmiş Biyotinilasyona Dayalı Subhücresel Ribozom Alt Popülasyonlarının İzolasyonu

Öğrenin peptidil-tRNA içeren çeviri ribozomlarını izole etme yöntemini. Biyotin etiketli mRNA ve streptavidin manyetik boncuklar kullanılarak fonksiyonel ve yapısal analizler yapılır.

Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Daha fazla video keşfet