Fonksiyonel ve Yapısal Analizler için Peptidil tRNAs İçeren Çeviri Ribozomlar izolasyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, benzersiz bir peptid tRNA içeren saf ribozomların yapısını ve işlevini analiz etmektir. Bu işlem, biotin etiketli mRNA'lara bağlı duraklatılmış pep tRNA ribozom kompleksleri oluşturmak için, salınım faktörlerinden arındırılmış hücre dışı ekstraktlar ve biotin etiketli mRNA'lar ile in vitro translasyon analizleri gerçekleştirilerek sağlanır. İkinci bir adım olarak, mRNA'da bulunan biotin molekülleriyle etkileşime girmelerini sağlamak amacıyla, streptavidin bağlı paramanyetik boncuklar in vitro translasyon analizleri ile karıştırılır.

Daha sonra, toplam reaksiyondan mRNA'lara bağlı duraksamış peptid-tRNA ribozom komplekslerini çeken manyetik alanlar kullanılarak boncuklar ekstrakte edilir. Ardından, saflaştırılmış peptid-tRNA ribozom kompleksleri, fonksiyon analizleri yapmak amacıyla salınım faktörü translasyonu, inhibe edici antibiyotikler veya kimyasal modifikasyon ajanları gibi translasyonel faktörlerle karıştırılabilir. Ribozomun inhibisyonu ve yapısına ilişkin sonuçlar; peptid transferaz aktivitesi veya SDS veya Tris-Racine PAGE jelleri kullanılarak yapılan translasyonel terminasyon analizleri ile üre PAGE jelleri kullanılarak yapılan modifikasyon koruma analizlerine dayanarak, peptid-tRNA'ların hidrolizinin inhibisyonunu ve bunun ribozomlardaki yapısal değişikliklerle korelasyonunu göstermektedir.

Bu tekniğin diferansiyel santrifüjasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, izole edilen örneklerin çoğunlukla yalnızca tek bir pep tRNA popülasyonuna sahip ribozomlar içermesidir. Bu yöntem, yeni sentezlenen polipeptitlerin doğası ve antibiyotiklerin translasyon sürecini modüle etmek gibi ribozom fonksiyonunu nasıl etkilediği gibi gen ekspresyonu alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, log fazı kültürlerinden iki gram kuru e coli bakteri peleti temin edin.

Peleti bir litre tampon çözeltide yeniden süspanse ederek yıkayın ve ardından 4 °C'de beş dakika boyunca 5,000 Gs hızında santrifüjleyin. İki yıkama işlemi gerçekleştirdikten sonra, elde edilen bakteri peletini 40 mililitre tampon çözeltide yeniden süspanse edin ve 6,000 PSI basınç uygulayan bir French pres kullanarak bakteri hücrelerini parçalayın. Bu basınç, bir inçlik piston kullanıldığında 600 birime tekabül eder.

Parçalanmış süspansiyonu 50 mililitrelik temiz bir cam tüpe toplayın. Parçalanmış süspansiyonu bir milimolar DIO triol veya DTT ile muamele edin ve örneği 30.000 Gs'de 30 dakika boyunca santrifüjleyin. Oluşan süpernatantı uzaklaştırın ve santrifüjleme işlemini tekrarlayın.

İkinci santrifüjden elde edilen süpernatantı saklayın ve final süpernatantı mikrotüplere paylaştırın. Son olarak, alikotları kuru buz-etanol karışımı veya sıvı azot kullanarak hızlıca dondurun ve numuneleri -60 veya -80 °C'de saklayın.

4,5 mililitre protein A spheros four B bulamaç boncuklarını beş mililitre anti RF two antiserumü ile karıştırarak RF two'dan arındırılmış hücre dışı ekstraktların hazırlığına başlayın. Karışımı oda sıcaklığında, döner bir çark üzerinde bir saat boyunca döndürün. Boncukları antiserumden ayırmak için karışımı 2.500 Gs'de santrifüjleyin.

Süpernatantı atın. Boncuklar artık anti RF iki antikorlarını içermektedir ve bundan böyle anti RF iki boncukları olarak adlandırılacaktır. Boncukları bir mililitre tampon b içinde yeniden süspanse ederek yıkayın.

Ardından, anti RF iki boncuklarını tampon B'den ayırmak için boncukları daha önce olduğu gibi santrifüjleyin. Bu yıkama işlemini iki kez tekrarlayın. Boncukları yıkadıktan sonra, bir mililitre hücresiz ekstraktı 150 µL anti RF iki boncuğu ile karıştırın ve inkübasyonun ardından dört °C'de döner bir tekerlek üzerinde iki saat boyunca inkübe edin. Hücresiz ekstraktı boncuklardan ayırmak için karışımı 10,000 ×g'de santrifüjleyin.

Süpernatantı uzaklaştırın ve inkübasyonu tekrarlayıp tekrar çöktürme işlemi yapmadan önce 150 µL daha anti RF iki boncuğu ile işleme tabi tutun. Nihai RF iki eksiltilmiş hücreden arındırılmış ekstrakt çözeltisini, tüp başına 100 µL olacak şekilde mikro tüplere paylaştırın. Alikotları kuru buz-etanol karışımı veya sıvı nitrojen kullanarak dondurun ve -60 veya -80 °C'de saklayın.

Çevrilecek dizileri içeren plazmit kalıbı, oligo deoksiribonükleotidleri, dNTP'leri, sağlam DNA polimerazı ve stratejik PCR tamponunu birleştirerek PCR reaksiyonunu hazırlayın. PCR örneği hazırlandıktan sonra amplifikasyon reaksiyonunu gerçekleştirin; PCR ürünlerini saflaştırmak için bir onda hacimce 3 molar sodyum asetat (pH 5.2) ve iki hacimce buz gibi soğuk etanol ekleyerek DNA'yı çöktürün. Çöktürme prosedürünü bir kez daha tekrarladıktan sonra, elde edilen DNA'yı 100 µL dietilperkarbonat veya DEPC ile işlem görmüş su içerisinde süspanse edin.

PCR ürünlerinin bütünlüğünü agaroz jeller üzerinde elektroforez ile doğrulayın. Bu prosedür tipik olarak 600 baz çiftlik bir DNA ürününden 100 mikrogram elde edilmesini sağlar. Beş mikrogram PCR kaynaklı DNA fragmanını, biotin etiketli UTP ribonükleotidleri ve T7 enzim karışımı ile DEPC işlem görmüş su içerisinde karıştırarak 100 mikrolitrelik bir in vitro transkripsiyon reaksiyonu hazırlayın.

Reaksiyon karışımını 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Elde edilen mRNA miktarını belirlemek için, RNA'sız DNaz ekleyerek DNA kalıbını ortadan kaldırın. Reaksiyonu 37 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin.

mRNA ürünlerini saflaştırmak için, bir onda hacimde üç molar sodyum asetat pH 5.2 ve iki hacim soğuk etanol ekleyerek RNA'yı iki kez çöktürün; çöken mRNA'yı 100 µL DEPC işlem görmüş su içinde yeniden süspanse edin. Biotin işaretli mRNA ürünlerinin bütünlüğünü agaroz jellerde elektroforez ile doğrulayın. Bu prosedür genellikle, peptid-tRNA içeren translasyon yapan ribozomların izolasyonuna başlamak için 600 nükleotitlik biotin işaretli mRNA ürününden bir ila iki miligram arasında verim sağlar. DEPC işlem görmüş su içerisinde 500 µL in vitro translasyon reaksiyon karışımı hazırlanır.

Öncelikle, beraberindeki yazılı protokolde açıklanan tamponlu reaksiyon karışımını hazırlayın ve ardından, radyoaktif bir amino asit ile değiştirilecek olan dışındaki amino asitlerin her birinden 75 M ekleyin. Sonra, amino asitleri içeren tampon çözeltiye 20 ila 50 µL RF iki eksiltilmiş hücreden arındırılmış ekstrakt ekleyin. Ribozomların aktivasyonuna izin vermek için karışımı oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin.

Ribozomlar aktive edildikten sonra, numuneye 10 ila 15 µg biotin işaretli mRNA ekleyin. Reaksiyon karışımını 37 °C'de 10 dakika inkübe edin.

Bu sırada, tampon C içerisinde üç mililitre streptavidin paramanyetik boncuk veya SMB hazırlayın. İnkübasyonun ardından, SMP süspansiyonunu translasyon reaksiyon karışımına ekleyin. Yeni süspansiyonu oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Manyetik ayırma standlarını kullanarak manyetik alan uygulayıp SMB'leri karışımdan ayırın. Yeniden süsp

SMB'yi tampon C içerisinde süspande edin ve manyetik stand kullanarak boncukları tekrar ayırın. Bu yıkama prosedürünü iki kez tekrarladıktan sonra, boncukları 500 µL tampon C içerisinde yeniden süspande edin. Süspansiyonu buz üzerinde saklayın ve bir sonraki prosedürü derhal gerçekleştirin. Peptid TRNA'yı görselleştirmek için, süspande edilmiş SMB ve tampon C'den 10 µL'yi 10 µL yükleme tamponu ile karıştırın; örnekleri %10 Tris tric poliakrilamid jellerde koşturarak boncuklara bağlı bileşenleri ayırın.

Jelleri bir vakumlu jel kurutucu kullanarak kurutun. Ardından, kurutulmuş jeli bir röntgen filmine maruz bırakarak peptit TRNA'nın bütünlüğünü ve saflığını doğrulayın. Ribozomal RNA'yı analiz etmek için, dpci ile işlem görmüş su ile hazırlanmış 2 mM EDTA çözeltisinden 190 µL, suyla dengelenmiş fenolden 200 µL ve bir boncuk süspansiyonundan 10 µL birleştirin.

Elde edilen süspansiyonu kuvvetli bir şekilde vorteksleyerek karıştırın. İnorganik fazı organik fazdan, oda sıcaklığında üç dakika boyunca 10, 000 Gs'de santrifüj ederek ayırın; üstteki su tabakasını yeni bir mikrotüpe toplayın. Su tabakasındaki RNA'yı, hacmin onda biri kadar üç molar sodyum asetat pH 5.2, 1 µL 20 mg/mL glikojen çözeltisi ve iki hacim buz soğukluğunda etanol ekleyerek çöktürün. Çöken RNA'yı 10 µL DEPC işlem görmüş su içerisinde yeniden süspanse edin.

Ribozomal RNA'ların bütünlüğünü niros jellerde elektroforez yaparak doğrulayın. Genellikle 50 µL boncuk süspansiyonu, bir µg ribozomal RNA sağlar. Burada, izole edilen translasyon yapan ribozomların kalitesini ve işlevselliğini değerlendiren bir dizi analizin sonuçları sunulmaktadır.

Poliakrilamid jellerde çözünürlüğe kavuşmuş benzersiz bir bandın gözlemlenmesi, SMB'ye tutunmuş biotin işaretli mRNA'lara bağlı polipeptitlerin varlığını gösterir. Ribozomal RNA'ların saflaştırılması. Bu prosedürün kullanılması, bu biotin işaretli mRNA'lara bağlı ribozomların varlığını da kanıtlar.

Ribozomun peptidil transferaz aktivitesini indükleyen bir antibiyotik olan purmisinin eklenmesi, yeni sentezlenen peptidil tRNA'ların kesilmesiyle sonuçlanır. Bu durum, poliakrilamid jellerde izole edilen polipeptidin migrasyon paternindeki bir kayma olarak gözlemlenir. Toplu olarak bu veriler, SMB'ye tutunmuş biotin işaretli mRNA'ların, peptidil tRNA'lar içeren fonksiyonel ribozomlar barındırdığını göstermektedir.

Spesifik peptid tRNA'lar içeren translasyonel ribozomların izolasyonu; peptid tRNA'ların, antibiyotiklerin ve diğer moleküllerin ribozom fonksiyonu ve ribozom yapısı üzerindeki etkilerinin incelenmesine olanak tanır. Burada sunulan örneklerde, parsamyn antibiyotiği ve triptofan amino asidi, izole ribozomlarda nascent TNAC tRNA peptid tRNA'nın RF two tarafından hidrolitik parçalanmasını inhibe etmektedir.

Triptofan veya sparsomisinle olan etkileşim, translasyon yapan ribozomun 23S rRNA'sını oluşturan bazı nükleotidlerde de yapısal değişiklikler meydana getirir. Uzmanlaşıldığında, bu tekniğin ana kısmı, prosedürlerin doğru şekilde takip edilmesiyle beş saat içinde tamamlanabilir. Benzersiz protein ve RNA içeren ribozom yapısına dair ek soruları yanıtlamak için cryo-EM gibi diğer yapısal analiz yöntemleri de uygulanabilir.