Name: Murin Pankreas Adacık İzolasyonu (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-22T00:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 20 s
Description: Öğrenin fare pankreas adacık izolasyonunu kollajenaz enjeksiyonu ve Ficoll gradyanı kullanarak. Bu yöntem diyabetik NOD farelerine transplantasyon için canlı adacıklar hazırlar ve diyabet tedavisinde ileri araştırmalara olanak tanır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Kollajenaz Hazırlık <ol><li> Son konsantrasyon, aşağıdaki tabloda gösterildiği gibi yapmak için bir 50 ml konik ve eklemek izolasyon tampon içine kollajenaz tartılır . Vorteks kollajenaz eritin. (12 farelere + 2 ekstra fareler = 14 farelerin x 5 ml / fare = 70 ml toplam kollajenaz çözüm) (70 ml x 0.5 mg / ml veya kollajenaz P toplam 0.3 mg / ml = 35 mg veya 21 mg) <table style="BORDER-RIGHT: #ddd 1px solid; BORDER-TOP: #ddd 1px solid; BORDER-LEFT: #ddd 1px solid; BORDER-BOTTOM: #ddd 1px solid; TEXT-ALIGN: left" border="0" width="80%"><tbody><tr><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Gerginlik </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Yaş </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Kollajenaz P (mg / ml) </th><th style="font-size: 12px; border-bottom: #ddd 1px solid; text-align: left"> Süresi (dak) </th></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 hafta </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> C3H, Balb / C, B6 </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 hafta </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 13 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR OLMAYAN </td><td style="font-size: 12px"> &gt; 12 hafta </td><td style="font-size: 12px"> 0,8 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr><tr><td style="font-size: 12px"> NOD, NOR OLMAYAN </td><td style="font-size: 12px"> &lt;= 12 hafta </td><td style="font-size: 12px"> 0,5 </td><td style="font-size: 12px"> 17 </td></tr></tbody></table> </li><li> Kollajenaz çözüm 2 ml cam şişe ve yeri içine buz üzerinde her koyun. Her kollajenaz eklemek 30g iğne ve buz (motor kapağı hazırlamak) 3 ml ile 5 ml şırınga yükleyin. </li></ol> Şişme <ol><li> Sadece diseksiyonu önce servikal dislokasyon hayvan kurban. Tamamen ıslak ETOH% 70 ile tüm vücut spreyi. Genital bölgede başlayan bir V-insision olun. Fare kuyruğu size bakacak şekilde çevirin. </li><li> Açık farenin sol tarafına bağırsak çıkarın. Bu, pankreas ve safra kanalı gösterecektir. </li><li> , Bağırsak girmek için kollajenaz çözümü için küçük bir cep bırakarak, safra yolları Kanalizasyona, küçük-bağırsak her iki tarafta bir hemostat kelepçe yerleştirin. </li><li> Pankreas, safra kesesi başlayan, safra yolları, 3 ml soğuk kollajenaz çözüm içeren bir 30g iğne ve 5 ml şırınga yoluyla şişirin. </li><li> Pankreas vücuttan çıkarın ve 2 ml kollajenaz çözüm içeren bir silikonlu flakon içine koyun. Bu adım, yağ ve bağ dokusu toplama en aza indirerek, hızlı ve mümkün olduğu kadar temiz olmalıdır . </li><li> Sonraki fare ile buz ve 3. adımı yineleyin Flakon yerleştirin. </li></ol> Sindirim <ol><li> Her flakon Seal ve 37 ° C su banyosu içine yerleştirin. 13-17 dakika (zaman gerginlik ve hayvanın yaşı ile değişir) inkübe edin. </li><li> Süre geçtikten sonra, şiddetle flakon sallayın. Pankreas ayrı düşmek gerekir. </li><li> 1000 ml steril bir beher içine büyük bir steril lavabo süzgeç vasıtasıyla her sindirmek dökün ve zorla yıkama tamponu ile ekran pipetle. Uygulama 50 ml conicals tüpler içine sindirir (3 pancreata/50 ml tüp: n = 12, son hacim 200 ml ve 4x50 ml tüpler dağıtmak için tampon yıkama yeterli kullanın). Seyreltme istenmeyen adacık sindirim önlemek için buz üzerinde ve hızla yapılmalıdır. </li><li> Spin: santrifüj Başlat. 1300 rpm ulaştığında, kapatın. </li><li> ~ 5 mL bırakarak, süpernatant aspire. Pelet aspire çok dikkatli olun. </li><li> Süspanse edin pelet şiddetle elinizle dokunarak, sonra 50 ml yıkama tamponu ekleyin. </li><li> Spin: santrifüj Başlat. 1300 rpm ulaştığında, kapatın. </li><li> Pelet ve yıkama 5 ml yıkama tamponu ile tekrar </li><li> 5 ml 15 ml konik transferi ve yukarıdaki gibi, aşağı doğru döndürün. </li><li> Süpernatantı mümkün olduğu kadar tamamen aspire. (Kalan tampon Ficoll yoğunluğu değişiklik neden olabilir.) </li></ol> Ficoll Hızlı gerçekleştirin. Uzun vadeli Ficoll maruz adacıklar için ZEHİRLİ. <ol><li> Pelet tamamen Ficoll (kesintisiz doku Ficoll tekrar süspansiyon için zor) eklemeden önce kırık emin olun. </li><li> Şiddetle vorteks Ficoll, yoğunluğu 1.108, 7 ml pelletini tekrar. </li><li> 1.096, 1.069, ardından 1.037: bu sırada kalan yoğunluklarının her Ficoll 2ml her yoğunluğu üst katman. </li><li> KAPALI break ile 4 derece 15 dakika 1800 rpm&#39;de döndür! </li><li> Spoid (steril p kullanarak ikinci kat adacıklar seçinLastic damlalık). Transfer tüm koleksiyonları, soğuk tampon 50 ml konik içeren ~ 25 ml. </li><li> Yıkama tamponu (adım 12-15 tekrar), yukarıdaki gibi, 3 kere yıkayın. </li><li> Içinde süspanse edin Islets 20 ml RPMI-1640 (% 10 FCS ve penisilin ve streptomisin, Hepes, MEM-NEAA içeren) ve hafifçe karıştırın. Sayımı için örnek 100 ul çıkarın. </li><li> 1 ml 1 ml dithizone medya ve içeren 35 mm Izgara plakası 100 ul aktarın. </li><li> Medya / plaka 30 ml toplam 160 mm plakalar, 37 ° C,% 7 CO 2 kuvöz, RPMI 1640 içerisinde kalan adacıklar inkübe edin. <img src="/files/ftp_upload/old/255_2008_8_24_3/255_Figure-01.png" alt="Şekil 1" width="220" height="194" /></li></ol>

murin pankreas adacık İzolasyonu

Murine Pancreatic Islet Isolation

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Merhaba, ben Greg Zott. UCSF Diyabet Merkezi'ndeki Bluestone Laboratuvarı'ndayım ve bugün size fare adacıklarının izolasyon sürecini göstereceğim. Prosedür, C3 H donör faresinin pankreasına bir kollajenaz çözeltisinin enjekte edilmesini, ardından bu pankreasın çıkarılmasını, sindirilmesini, adacıkların bir yoğunluk gradyanı üzerinde saflaştırılmasını ve son olarak alıcımız olacak diyabetik bir NOD faresinin böbrek kapsülüne nakledilmek üzere elle seçilmesini içermektedir.Bu prosedüre başlamadan önce, ATE çözeltimizi modifiye edilmiş bir Hanks tamponu ile seyrelttik ve kullandığımız fare suşu olan C3 H'ye özgü konsantrasyonu ayarladık. Sindirimlerin 0,8 mg/mL kollajenaz çözeltisinde daha iyi olduğunu tespit ettik ve pankreası genişletmek için ortak safra kanalına enjekte etmek üzere bu çözeltiyi kullanacağız. Prosedürü bugün Diyabet Merkezi'nden Pavo Codre gerçekleştirecektir. Fareyi açacak, bağırsakları ortaya çıkaracak ve ardından ortak safra kanalına enjeksiyon yapacaktır.Tüyleri yatıştırmak için fareyi etanol ile spreyleyeceğiz ve ardından ayak parmağı sıkıştırma yöntemiyle farenin uygun şekilde sakrifiye edildiğini doğrulayacağız. Pavo şimdi midline insizyon ile fareyi açarak bağırsağı ve pankreası ortaya çıkaracak. Farenin sakrifiye edildiğini doğrulamak için diyafram da kesilecek.Başlamadan önce, bazı önemli yapıları belirtmek istiyorum. Mide tam burada yer alıyor, pankreas ise alt taraftan duodenum'a ve üst tarafa bağlıdır. Safra kesesini ve hemen burada gördüğünüz ana safra kanalını bulacağımız yer ise karaciğerdir.Şimdi Pavo'nun yapacağı işlem, ince bağırsağı izole etmek ve ortak safra kanalının ince bağırsağa girdiği noktayı bulmaktır. Bağırsak açığa çıktıktan sonra, ortak safra kanalının her iki yanını mosquito klemplerle sıkıştırıyoruz. Diğer gruplar klembi ortak safra kanalının üzerine yerleştirmeye çalışırken, biz bu yöntemin pankreasa daha fazla kolajenat girmesine izin verdiğini görüyoruz.Bu tekniğin, enzimin pankreasa girmesini sağlamada daha etkili olduğunu saptadık. Bu, nazik bir işlemdir. Bağırsakların yırtılmasını istemezsiniz.Klemplerin ana safra kanalının her iki yanına nazikçe yerleşmesini sağlamalısınız. Şimdi safra kesesini bulacağız ve safra kesesi açığa çıktığında, kolajenazın ana safra kanalına enjekte edilmesi için bunu bir kılavuz olarak kullanacağız. Powell, üç mL kolajenaz çözeltisi içeren beş cc'lik bir şırınga ile 30 gauge'lik bir iğne kullanıyor.Ana safra kanalına girerken, kanalı kollajenaz çözeltisiyle genişletiyor ve bağırsak yakınlarına ulaşana kadar ana safra kanalı boyunca ilerliyor. Aşağı doğru ilerlerken, enzim çözeltileri pankreasa pompalanıyor/enjekte ediliyor. Pankreas kollajenaz çözeltisiyle şişirildiğinde, Powell hemostatları çıkaracak ve ardından pankreası bağırsaktan dikkatlice ayırarak fareden çıkaracaktır.Organı mideden ayırıyor. Tamam, ardından dalağı tutacak olarak kullanarak pankreası yukarı kaldırıyor ve sonra ortak safra kanalından yavaşça kesip ayırıyor, işte bu kadar. Pankreas ortaya çıkarılıyor ve ardından dalak çıkarılıyor; burada mezenterik dokuyu temizliyor ve ardından pankreas, sterilize edilmiş cam bir şişe içindeki 2 mg/mL kollagenase çözeltisine yerleştirilerek tekrar buz üzerine konuluyor.Cam tüplere koyduğumuz izole pankreas, şimdi yaklaşık 17 dakika boyunca 37 °C'lik bir su banyosuna yerleştirilecektir. Yüzeye çıkmamaları için tüpleri 50 ml'lik konik bir rafa yerleştirdik. Su banyosu sırasında zamanlayıcı başlatılır ve sindirim işlemi başlar.Sindirimi süresi tamamlandığında, vialler çıkarılır, ardından sallanarak nazikçe parçalanır. Doku parçalanmaya başladığında, vial buz üzerine yerleştirilir. Yıkama tamponu içeren 400 ml'lik bir beherin üzerine steril bir süzgeç yerleştirilir.Ardından pankreas digesti, süzgeç üzerinden dikkatlice yıkama tamponuna dökülür. Gösterim amacıyla, ne yaptığımızı görebilmemiz için çeker ocak kapatılmış ve camı kaldırılmıştır. Pankreas digesti behere döküldükten sonra, tüpler aynı yıkama tamponu ile durulanır ve yıkama tamponu süzgeç üzerine yerleştirilir.Yıkama tamponu ile doldurulmuş bir şırıngamız var. Bunu, dokuyu süzgeçten zorlayarak yıkamak için kullanacağız. Buradaki amaç, matrise tutunmamış olan gevşek gözleri serbest bırakmak, ancak membranları ve sindirilmemiş dokuyu süzgeç üzerinde bırakmaktır.Bir dokuyu yıkamayı bitirdiğinizde, prosedürün sonunda genellikle bunu görürsünüz. Tüpün dibindeki pankreas dokusu şimdi iki adet 50 ml konik tüpe aktarılacak; doku yıkanacak, homojen şekilde karıştırılacak ve ardından her tüpte eşit pellet hacmi olacak şekilde eşit olarak paylaştırılacaktır. Beher şimdi daha fazla yıkama tamponu ile durulanır.Behere giren tüm dokuların geri alınması için kenarlar durulanır. Ardından, içerik her iki 50 ml'lik konik tüpe eşit olarak paylaştırılır. Daha sonra konik tüpler yıkama tamponu ile doldurulur.Doku birkaç kez altüst edilir ve ardından bir santrifüje yerleştirilir. Bu, hızlı bir çevirmedir. Santrifüjün 1000 RPM hıza ulaşması beklenir ve ardından kapatılır.Doku bu aşamada çok hassastır ve onları fazla sıkıştırmak istemezsiniz. Tüpler çıkarılır ve bu yıkama adımını üç kez daha tekrarlayacağız. Bu, üçüncü yıkamanın sonudur.50 ml'lik konik tüpteki bileşenler 15 ml'lik konik tüpe aktarılır, 1000 rpm'de santrifüj edilir ve ardından durdurulur. Süpernatan uzaklaştırılır ve FI Call'un ilk aşamasına geçilir. Şu an, peletlenmiş pankreas sindirimine sahip olduğumuz aşamadayız.Peletlerin üzerinden güzelce çözünmesi için dokuyu yeniden süspande edeceğiz. İlk yoğunluk gradyanı olan 1 1 0 8'i ekleyeceğiz. Her tüpe beş ml ekleyeceğiz.Ardından pellet, gradyanların her birinde iyice karıştırılır. En ağır gradyanınızda iyi bir doku dağılımı elde etmeniz önemlidir. Şimdi, 1 0 9 6 yoğunluğunda iki ml ekleyeceğiz.Ardından bunun üzerine, iki mil kalınlığında 1 0 6 9 yoğunlukta bir katman ve onun üzerine de 1 0 3 7 yoğunlukta bir katman ekleyeceğiz. Yoğunluk katmanlarını oluştururken bunları birbirine karıştırmamanız önemlidir. Böylece tüm katmanlar tüpe eklenmiş olur.Burada 1 1 0 8'in, 9 1 0 9 6'nın, 1 0 6 9'un ve 1 0 3 7'nin üst kısımlarını görebilirsiniz. Santrifüjleme yapılmasa dahi dokunun halihazırda uygun yoğunluğuna doğru hareket etmeye başladığını görebilirsiniz. Final gradyanları 1800 RPM'de 15 dakika boyunca hızlandırılır ve tüpler santrifüjden çıkarıldıktan sonra frenin kapalı tutulduğundan emin olun.0 0 9 6 ve 0 0 7 tabakası arasında, Pablo'nun belirgin bir adacık dokusu bandı görebilirsiniz. Şimdi, işlem sırasında salınmış olabilecek doku kalıntılarını ve DNA'yı temizlemek için 0 3 7 tabakası kaldırılıyor. Steril plastik bir pastör pipeti kullanarak, adacık tabakasını alacak ve bunları 25 mL yıkama tamponu içeren 50 mL'lik konik tüpe aktaracaktır.Fol, eyeletler için toksik olduğundan bu adımı hızlıca yapmanız gerekir. Aslında 0 6 9 ve 0 9 6 katmanının tamamını kaldırdık. Pavo, plastik pastur pipetinin üst kısmını keser ve yıkama tamponu ile durular.Gözilmekler daha sonra daha önce yaptığımız gibi santrifüj edilir. Santrifüj 1000 RPM hıza çıkarılır, ardından durdurulur ve üst faz aspire edilir. Gözilmekler, yıkama medyumu ile üç kez yıkanacaktır.Böylece göz adacığı izolasyon sürecini tamamlamış olduk; digest aşamasından başlayarak fol gradyanına ve ardından üçüncü yıkama tamponu ile yıkamadan sonra saflaştırılmış göz adacıklarına ulaştık. Göz adacıklarını RPMI medyumunda yeniden süspanse ettik ve bir doku kültürü plağına yerleştirdik. Bu göz adacıkları artık in vitro analizler veya göz adacığı nakli gibi in vivo hazırlıklar için hazırdır.

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu için prosedürler: değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanılarak (bölüm I sindirim ve pankreas dokusu toplanması).

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm I: Sindirim ve Pankreas Doku Koleksiyon

, Yüksek kalite ve insan adacıklar uygun miktarda sağlamak başarılı bir adacık nakli için önemli önkoşullar biridir. Bu video, adım adım tarif insan pankreas adacık izolasyonu (Bölüm II: insan adacıklar arıtma ve kültür) için prosedürleri değiştirilmiş bir otomatik yöntemi kullanarak.

İnsan Pankreas Adacık İzolasyonu: Bölüm II: İnsan Islets saflaştırılması ve Kültür

Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

diyabet araştırma alanı için kritik zorluklar adacık β-hücre çoğalmasını düzenleyen ve β-hücre yenilenmesini teşvik etmek için yöntemler geliştirmek moleküler mekanizmalarını anlamak için vardır. Burada yüksek içeriği tarama yöntemi belirlemek ve küçük moleküllerin β-hücresi replikasyon teşvik aktivitesi sunulmuştur değerlendirmek.

Bir Yüksek içerik<em&gt; İn Vitro</em&gt; Pankreas Adacık β-hücre çoğaltma Keşif Platformu

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Burada, pankreas adacık hücreleri gibi heterojen hücre popülasyonlarında kalsiyum dinamiğinin görüntülenmesi ve ölçülmesi için bir protokol saklıyız. Floresan muhabirler adacık içindeki hücrelerin periferik tabakasına teslim edilir, daha sonra hareketsiz hale getirilir ve görüntülenir ve floresan yoğunluğunun dinamiğinin hücre başına analizi yapılır.

Fare Pankreas Adacık Hücrelerinin Alt Popülasyonlarında Görüntüleme Kalsiyum Dinamiği

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Öğrenin fare pankreas adacık izolasyonunu kollajenaz enjeksiyonu ve Ficoll gradyanı kullanarak. Bu yöntem diyabetik NOD farelerine transplantasyon için canlı adacıklar hazırlar ve diyabet tedavisinde ileri araştırmalara olanak tanır.

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Daha fazla video keşfet