Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Merhaba, ben Greg Zott. Bluestone Laboratuvarı'ndaki UCSF Diyabet Merkezi'ndeyim ve bugün size fare deliklerini izole etme sürecini göstereceğim. Prosedür, bir C3 H donör farenin pankreasına bir kollajenaz çözeltisinin enjekte edilmesini içerir, burada daha sonra bu pankreası çıkaracağız, sindireceğiz, delikleri bir fial gradyan üzerinde saflaştıracağız ve daha sonra bunları diyabetik bir NOD faresinin böbrek kapsülüne nihai nakil için elle seçeceğiz, Bu bizim alıcımız olacak.

Bu prosedüre başlamadan önce, ATE çözeltimizi modifiye edilmiş bir Hanks tamponunda seyrelttik ve C3 H'yi kullandığımız farenin türüne özgü konsantrasyonu ayarladık. Gerçekleştirme. Bugünkü prosedür diyabet merkezinin Pavo codre'si olacak. Enjekte edecek, fareyi açacak, bağırsakları açığa çıkaracak ve daha sonra ortak safra kanalına enjekte edecek.

Saçı aşağıda tutmak için fareye etanol püskürteceğiz ve ardından farenin bir ayak parmağı tutamıyla düzgün bir şekilde feda edildiğini doğrulayacağız. Pavo şimdi fareyi açacak ve orta hat kesisi ile bağırsağı ve pankreası açığa çıkaracak. Farenin feda edileceğini doğrulamak için diyafram da kesilecektir.

Başlamadan önce, bazı önemli yapılara dikkat çekmek istiyorum. Mide tam burada, pankreas altında duodenuma ve üstüne bağlı olarak yatıyor. Burası safra kesesini ve safra kanalını bulacağımız karaciğer, burada gördüğünüz gibi.

Pavo'nun bundan sonra yapacağı şey, ince bağırsağı izole etmek, ortak safra kanalının ince bağırsağa nereden girdiğini bulmak. Bağırsak açığa çıktığında, ortak safra kanalının her iki tarafına sivrisinek kelepçeleri ile kelepçeleriz. Bunun, daha fazla kollajenatın pankreasa girmesine izin verdiğini, diğer grupların ise kelepçeyi ortak safra kanalının üstüne yönlendirmeye çalıştığını bulduk.

Bunun, enzimin pankreasa girmesine izin vermede daha iyi bir teknik olduğunu bulduk. Bu nazik bir prosedürdür. Bağırsağı yırtmak istemezsin.

Kelepçelerin ortak safra kanalının her iki tarafında nazikçe uzanmasına izin vermek istersiniz. Şimdi bir safra kesesi bulacağız ve safra kesesi açığa çıktığında, bunu kollajenazı ortak safra kanalına enjekte etmek için bir kılavuz olarak kullanacağız. Powell, üç değirmen kollajenaz çözeltisi içeren beş cc'lik bir şırınga ile 30 kalibrelik bir iğne kullanıyor.

Ortak safra kanalına girerken, bu kanalı kollajenaz solüsyonu ile şişiriyor ve daha sonra bağırsağın yakınına ulaşana kadar ortak safra kanalından aşağı doğru hareket ediyor. Ve aşağı inerken, enzim çözeltileri pankreasa enjekte ediliyor. Artık pankreas kollajenaz solüsyonu ile şişirildiğine göre, Powell kanama durdurucuları çıkaracak ve ardından pankreası fareden dikkatlice bağırsaktan kopararak çıkaracak.

Onu mideden çıkarır. Tamam, sonra dalağı tutamak olarak kullanarak, pankreası yukarı kaldırıyor ve sonra yavaşça ortak safra kanalında kesiyor, hepsi bu. Pankreas yerleştirilir ve sonra dalak çıkarılır ve orada mezo enterik dokuyu çıkarır ve sonra pankreas iki değirmenli kollajenaz solüsyonuna ve sterilize edilmiş bir cam şişeye yerleştirilir ve tekrar Buz'a yerleştirilir.

Cam şişelere koyduğumuz izole pankreas şimdi yaklaşık 17 dakika boyunca 37 derecelik bir su banyosuna yerleştirilecek. Onları 50 mil konik bir rafa yerleştirdik, böylece yüzmesinler. Banyo sırasında bir kez, zamanlayıcı başlar ve sindirim başlar.

Sindirim süresi tamamlandıktan sonra şişeler çıkarılır ve ardından hafifçe çalkalanır ve bozulur. Ve doku parçalanmaya başladığında, flakon daha sonra buzun üzerine yerleştirilir. Yıkama tamponu içeren 400 mil'lik bir beherin üzerine steril bir elek yerleştirilir.

Pankreas digesti daha sonra dikkatlice elek üzerine yıkama tamponuna dökülür. Gösteri amacıyla, kaput kapatıldı ve ne yaptığımızı görebilmemiz için davlumbazın camı kaldırıldı. Pankreas digesti behere döküldükten sonra, şişeler aynı yıkama tamponu ile durulanır ve yıkama tamponu elek üzerine yerleştirilir.

Yıkama tamponu ile dolu bir şırıngamız var. Bunu, dokuyu ekrandan zorla yıkamak için kullanacağız. Buradaki fikir, matrise bağlı olmayan gevşek delikleri serbest bırakmak, ancak zarları ve sindirilmemiş dokuyu ekranda bırakmaktır.

Ve bir mendili yıkamayı bitirdiğinizde, genellikle prosedürün sonunda gördüğünüz şey budur. Tüpün dibindeki Pankreas dokusu şimdi iki adet 50 mil konik bölgeye aktarılacak ve doku yıkanacak, doku eşit şekilde karıştırılacak ve daha sonra eşit bir şekilde dağıtılacak, böylece her tüpte eşit bir pelet hacmine sahip olacağız. Beher şimdi daha fazla yıkama tamponu ile durulanır.

Kenarlar durulanır, böylece behere giren tüm dokuları tekrar alırsınız. Daha sonra her ikisi arasında eşit olarak dağıtılır, her ikisi de 50 mil. Konik daha sonra yıkama tamponu ile doldurulur.

Doku birkaç kez ters çevrilir ve daha sonra bir santrifüje yerleştirilir. Bu hızlı bir dönüş. Santrifüjün bin PPM'ye ulaşmasına izin verilir ve ardından kapatılır.

Şu anda doku çok S halkaları çok hassastır ve onları fazla sıkıştırmak istemezsiniz. Tüpler çıkarılır ve bu yıkama adımını üç kez daha yapacağız. Bu üçüncü yıkamanın sonu.

50 mil konik borunun bileşenleri, 15 konik boruya aktarılır ve bin RP M için santrifüjlenir ve daha sonra durdurulur. Supernat kaldırılacak ve FI Çağrısının ilk kısmı başlatılacaktır. Peletlenmiş di pankreasımızı sindirdiğimiz adımdayız.

Bu dokuyu yeniden askıya alacağız, böylece güzel ve peletler için gevşek olacak. 1 1 0 8 olan ilk yoğunluk gradyanını ekleyeceğiz. Her tüpe beş mil ekleyeceğiz.

Pelet daha sonra gradyanların her birinde iyice karıştırılır. En ağır gradyanınızda iyi bir doku dağılımı elde etmeniz önemlidir. Şimdi 1 0 9 6 yoğunluğunda iki mil katmanlayacağız.

Daha sonra bunun üzerine, 1 0 6 9 yoğunluğunda iki mil katman oluşturacağız ve ardından bunun üzerine 1 0 3 7 yoğunluğu ekleyeceğiz. Karıştırmadığınız yoğunlukları katmanlara ayırırken önemlidir. Daha sonra tüm katmanlar tüpe eklenir.

Ve gördüğünüz gibi bu 1 1 0 8'in tepesi, 9 1 0 9 6'nın tepesi, 1 0 6 9'un tepesi ve 1 0 3 7'nin tepesi. Ve dokunun zaten centri füzyonu olmadan bile uygun yoğunluğuna hareket etmeye başladığını görebilirsiniz. Fial gradyanlar 15 dakika boyunca 1800 RPM'de hızlandırılır ve tüpler santrifüjden çıkarıldıktan sonra freni kapalı tutmayı unutmayın.

0 0 9 6 ve 0 0 7 katmanları arasında görebilirsiniz, Pablo'nun güzel bir kuşgözü dokusu bandı var. Şimdi, işleme sırasında salınmış olabilecek doku kalıntılarını ve DNA'yı çıkarmak için 0 3 7 katmanını çıkarın. Steril bir plastik mera pipeti kullanarak, şimdi adacık tabakasını çıkaracak ve bunları 25 mil yıkama tamponu içeren 50 mil konik bir yüzeye aktaracaktır.

Bu adımı hızlı bir şekilde yapmak istersiniz çünkü fol kuşgözleri için toksiktir. Aslında 0 6 9 ve 0 9 6 katmanının tamamını kaldırdık. Pavo, plastik mera pipetinin üst kısmını keser ve yıkama tamponu ile durular.

Delikler daha sonra daha önce santrifüjlediğimiz gibi santrifüjlenir. Santrifüj Bin RPM'ye getirilir ve sonra onu durdururuz ve aspire ederiz. Süpernatan halkalar, yıkama ortamı ile üç kez yıkanacaktır.

Bu yüzden sindirimden fol gradyana ve saflaştırılmış halkalara kadar aldığımız göz kapağı izolasyon işlemini yıkama tamponu ile üçüncü yıkamamızdan sonra tamamladık, halkaları RPMI ortamımızda yeniden askıya aldık ve bir doku kültürü plakasında oynattık. Bu kuşgözü artık in vitro tahliller veya kuşgözü nakli gibi in vivo hazırlıklar için hazırdır.