Embriyonik Fare Böbrek Nefrojenik Zone Hücreleri İzolasyon ve Kültür

Bu prosedürün genel amacı, gelişmekte olan böbrekten nefrojenik zon hücrelerinin bir primer kültürü oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle 17,5 günlük embriyolardan böbreklerin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün bir sonraki adımı, böbrek kapsüllerinin çıkarılmasıdır.

Ardından, kap mesenkimini ve kortikal stroma hücrelerini nefrojenik bölgeden ayırmak için organların sınırlı bir enzimatik sindirimi gerçekleştirilir. Prosedürün son adımı, hücrelerin fibronectin içeren plaklara ekilmesi ve serumsuz ortamda kültüre edilmesidir. Sonuç olarak, spesifik belirteçlerin immün boyaması ile saflaştırılmış bir nefrojenik bölge hücre popülasyonunun varlığını gösteren bulgular elde edilebilir.

Bu yöntem hücre sinyalizasyonunu incelemek için kullanılabileceği gibi, hücresel genişleme için gereken substrat gereksinimlerini anlamak amacıyla da uygulanabilir. Örneğin, engraftman teknikleri için prosedürü laboratuvarımdaki teknisyen Derek Adams ve laboratuvarımdaki doktora sonrası araştırmacı Aaron Brown gösterecektir. Gerekli çözeltileri hazırlayıp doku kültürü kaplarını yazılı protokole göre işledikten sonra, anneyi E 17.5 aşamasında feda ederek fare embriyonik böbrek diseksiyonuna başlayın.

Kurumsal yönergelerinize uygun olarak uterusu çıkarın ve birkaç mililitre kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS veya DPVS içeren bir Petri kabına yerleştirin. Bir diseksiyon mikroskobu altında, her bir embriyoyu çıkarmak için saatçi pensi ve dekapite etmek için başka bir pens kullanın. Tüm yavru grubu uterustan çıkarılıp dekapite edildikten sonra, embriyoları, onları örtecek kadar kalsiyum ve magnezyum içeren DPBS bulunan temiz bir Petri kabına aktarın.

Her embriyo için mümkün olduğunca fazla kan ve doku kalıntısı bırakın, pens ile göbek bağlarının hizasındaki karın duvarına çevresel bir insizyon yapın. Ardından embriyoyu sırt üstü yerleştirin ve omuzları bir set pens ile sabitleyin. İkinci bir set pens kullanarak, akciğerlerden mesaneye kadar olan iç organları çıkarın.

Böbrekler, iç organ kütlesinin arka kısmına tutunmuş olacaktır. Ardından, böbrekleri diğer organlardan nazikçe ayırın. Böbreklerin birbirine bağlı kalmasına dikkat edin.

Ardından, böbrekler arasındaki dokuyu bir forseps setiyle tutun ve diğer forsepsle böbreklerden birinin kapsülüne yapışık olan adrenal bezi kavrayın. Kapsülü böbrekten nazikçe soyun. Böbreğe zarar vermemeye dikkat edin.

Böbrekteki ve hala bağlıysa uterodaki kalan tüm kapsülleri temizlediğinizden emin olun. İşlemi diğer böbrek için tekrarlayın. Son olarak, bir transfer pipetini uygun bir çapta kesin ve böbrekleri nazikçe beş mililitrelik bir polystyrene HBSS tüpüne aktarın.

Böbrek izolasyonunu her embriyo için tekrarlayın ve steril bir ortamda, tüp başına en fazla sekiz böbrek gelecek şekilde böbrekleri tüpte birleştirin. Böbrekleri içeren beş mililitrelik tüpteki HBSS çözeltisini bir pipetle çekerek enzimatik sindirim işlemine başlayın. Böbreklere temas etmemeye dikkat edin ve hemen 1,5 mililitre kollagenaz (bir Pancreatin sindirim çözeltisi) ekleyin.

Her bir böbrek tüpü için işlemi tekrarlayın ve tüpleri kapatın. Ardından, tüpleri 37 °C'lik bir inkübatördeki bir karıştırıcıya 15 dakika boyunca yerleştirin. İnkübasyonun tamamlanmasından hemen önce, gerçekleştirilen her bir sindirim için taze bir 5 mL polistiren tüpe üç µL 1 unit/µL DNAs ekleyin.

İnkübasyonun ardından, digesti hızlıca inkübatörden çıkarın ve karıştırmak için üç kez ters yüz ederek 75 µL FBS ekleyin. Oda sıcaklığında iki dakika bekletin. Ardından, hücre süspansiyonunun 1,4 mL'sini DNAs Mix içeren beş mL'lik bir polistiren tüpe aktarın ve 37 °C'lik bir inkübatördeki rotatöre 10 dakika boyunca yerleştirin.

İnkübasyonu takiben, her bir hücre süspansiyonunu 1.5 mililitrelik bir eppendorf tüpüne aktarın ve 325 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantı uzaklaştırın; tüpleri 325 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Peleti, pipetle beş ila altı kez aşağı yukarı çekerek 1 mililitre %5 FBS-HBSS içinde yeniden süspande edin.

Bir sonraki örneğe geçmeden önce her tüpün kapağını kapatın. Santrifüj işleminin ardından SNAT'ı çıkarın ve tüm tüplere besiyeri eklendikten sonra her tüpe katkı maddeleri içeren 500 microliters KSFM ekleyin. Bir mil liter mikro pipet ile beş ila altı kez yukarı aşağı pipetleme yaparak her bir hücre peletini nazikçe yeniden süspanse edin. Tüm hücre süspansiyonlarını taze bir beş milliliter polistiren tüpte birleştirin.

Şimdi hücre süspansiyonunu, önceden ıslatılmış 40 mikronluk bir hücre süzgeç kapağından süzün ve süzüntüyü yeni bir polistiren tüpe toplayın. Tüm süzüntü toplandıktan sonra pipet ucuyla süzgece dokunmamaya dikkat edin. Süzüntüyü, yeni ve önceden ıslatılmış bir hücre süzgecinden geçirerek ikinci kez süzün.

Süzgeci çıkarın ve tüpü yeni bir tüpten alınan taze steril bir kapakla kapatın. Hücreleri sayın ve fiber kodlu bir kültür plağındaki katkı maddeli KSM ortamına, santimetrekare başına 100.000 ila 200.000 hücre yoğunluğunda ekim yapın. Herhangi bir deneysel stimülasyon öncesinde, nefrojenik zon hücrelerinin toparlanması ve tutunması için hücreleri 37 °C ve %5 karbon dioksit içeren nemlendirilmiş bir inkübatörde iki ila dört saat bekletin.

Burada, santimetrekareye 200.000 hücre olarak ekilmiş ve 24 saat boyunca kültüre edilmiş nefrojenik zon hücrelerinin faz kontrastlı 20 x görüntüsü gösterilmektedir. Bu görüntüde, nefrojenik zon hücreleri nefron öncül hücrelerine özgü olan anti PAX2 antikoru ile kırmızı renkte boyanmış, çekirdekler ise dapi ile mavi renkte karşıt boyanmıştır.

Nefron öncül hücre kümesinin faz kontrast görüntüsü 40 x büyütmede gösterilmiştir. Özgüllüğü daha fazla kanıtlamak için, stromal hücre popülasyonunda eksprese edilen Fox D one promotörünün kontrolü altında laxy bulunan embriyolardan nefrojenik zon hücreleri izole edilmiştir. Gelişen böbreğin nefrojenik zonu içindeki hücreler daha sonra çekirdekler için mavi renkte DAPI Titan fi, F aktin için yeşil renkte foin ve kırmızı renkte anti beta laktaz ile boyanmıştır.

Yöntem uzmanlaşıldıktan sonra, nefrojenik zon hücrelerinin tek tabakalı primer kültürü yaklaşık iki saat içinde oluşturulabilir. Bu kültürler; virüs transduksiyonuna, rekombinant protein uygulamalarına ve küçük molekül tedavilerine oldukça elverişli oldukları için, nefron öncül gelişimindeki hücre sinyal yollarının hızlı ve yüksek verimli çalışmalarını kolaylaştırır. Bu kültürlerden spesifik hücre tiplerini izole etmek için ayrıca hücre ayıklama prosedürleri de kullanılabilir.