Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini çeşitli primitif ve definit hematopoetik soy hücrelerine farklılaştırmaktır. Tüm ES hücre progenilerini karakterize etmek için fare hematopoetik hücre farklılaştırması, ES hücrelerinin konfluens halindeki floresan işaretli M strawberry OP nine stromal hücre tabakasına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Farklılaştırmanın veya ko-kültürün her bir günü, uygun hasat zamanındaki hematopoetik gelişimin çeşitli aşamalarını temsil eder.

Farklılaşmış ES hücre türevleri, hücre ayırma yöntemiyle M strawberry OP nine stromal hücre hattından ayrılabilir. Bu ES farklılaşma protokolü, in vivo gözlemlenen primitif ve definit hematopoiezi yeniden oluşturur ve embriyo kullanımı gerekmeksizin, knockout ES hücre hatlarıyla ilişkili hematopoetik defektlerin karakterizasyonunda kullanılabilir. Merhaba, UCLA'in Johnson Kapsamlı Kanser Merkezi'ndeki Dr. Judith Gassen'in laboratuvarına hoş geldiniz.

Benim adım Alicia Poz. Bugün size göstereceğim tekniğin mevcut ESO nine ko-kültür yöntemlerine göre temel avantajı, bu prosedürün tüm beşinci ve sekizinci gün hücrelerinin pasajlanmasına ve tüm ES türevli progenylerin tamamen ayrıştırılmasına olanak tanımasıdır. Dokuz stroma M strawberry OP nine hücreleri, her iki günde bir değiştirilmesi gereken OP nine hücre kültürü ortamında büyütülür.

OP9 hücreleri, ko-kültür için ihtiyaç duyulmadan üç gün önce pasajlanmalıdır. Bakım sırasında OP9 hücrelerinin yoğunluğunun asla %90 konfluensin üzerine çıkmaması gerektiği unutulmamalıdır. İlk olarak hücreleri iki kez PBS ile yıkayın, ardından ön ısıtılmış 0.1% tripsin EDTA ekleyip beş dakika bekleyin. Hücreler ayrıldığında, OP9 hücre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 50 mL'lik konik tüpe aktarın.

Santrifüjden sonra hücreleri oda sıcaklığında 300 G'de beş dakika boyunca tüpte peletleyin, süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri taze M strawberry OP nine hücre kültürü ortamında yeniden süspande edin; ko-kültür deneyinin başladığı gün hücreleri santimetrekare başına minimum 10⁴ hücre yoğunluğunda plaka edin. Üç gün önce pasaja alınmış olan OP nine hücreleri konfluen olmalıdır. ES hücreleri, kullandığınız spesifik hücre hattı için standart protokole göre kültüre edilmelidir.

ES hücrelerini iki kez PBS ile yıkayın, 0,25% trypsin EDTA ile tripsinize edin ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, ES hücrelerine ko-kültür diferansiyasyon medyumu ekleyin ve hücreleri 15 ml'lik konik tüplere aktarın. ES hücrelerini oda sıcaklığında, 400 g'de beş ila yedi dakika boyunca pelletleyin.

Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra ES hücrelerini ko-kültür farklılaşma ortamında yeniden süspande edin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 21 gauge küt uçlu iğne kullanın. Hücreleri tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak sayın.

Şimdi M çilek flaskını geri alın. İnkübatörden OP nine hücrelerini çıkarın. OP nine hücrelerindeki medyumu uzaklaştırın ve flask plakasına ko-kültür farklılaşma medyumu ekleyin.

Her bir M strawberry OP nine hücreli flaska santimetrekare başına 1×10³ ES hücresi ekleyin; hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit ve nem altında inkübe edin. Bu gün sıfırdır ve ko-kültür bu şekilde görünmelidir. ES M strawberry OP nine ko-kültürünün başlangıcından üç gün sonrası.

Çoğunlukla belirgin sınırlara sahip, ES kaynaklı progeniden oluşan büyük düz kümeler gözlemlenir ve bazı hücre girdapları oluşmaya başlamış olacaktır. Ko-kültürün başlamasından beş gün sonra, ortamı ko-kültürden dikkatlice uzaklaştırın ve taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. Konfluent bir M strawberry OP nine hücre tabakası üzerinde ES hücrelerinin uygun şekilde farklılaşması, üst üste binmiş hücre dünyaları şeklinde görünen hematoblastlar ile sonuçlanmalıdır.

Bu prosedürün en kritik yönü, ko-kültürün beşinci gününde uygun farklılaşmayı sağladığınızdan emin olmaktır. Bu noktada, insan blastosist kolonilerini sadece mikroskobik olarak değil, makroskobik olarak da görebilirsiniz. Ko-kültürü PBS ile iki kez dikkatle yıkayın ve hücreleri %0,25 tripsin EDTA ile tripsinizize edin, hücreleri ES farklılaşma medyası ile flasktan yıkayarak bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 400 G'de santrifüj ederek pelletleyin.

Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve yeni besiyeri ekleyin. Ardından, hücreleri yeniden süspanse etmek için 21 gauge küt uçlu bir iğne kullanın ve tek hücre süspansiyonu sağlandığından emin olmak için hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; sıfırıncı günden itibaren ES hücre sayısında 100 ila 150 katlık bir artış olmalıdır. Sekizinci veya dokuzuncu günde, ko-kültür hücrelerini konfluen M strawberry OP nine hücrelerinin yeni bir tabakasına yeniden ekin ve 12. günde hücreleri tekrar sayın. Hematopoetik hücreleri içeren besiyerini uzaklaştırın ve saklayın.

Süspansiyondaki hematopoetik hücreleri uzaklaştırmak için tek katmanlı tabakayı bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri saklayın. Tripsin ile yapışan hücreleri flasktan uzaklaştırmak için flaska %0,25 tripsin EDTA ekleyin; hücreleri ES diferansiyasyon medyası ile yıkayıp flasktan sökerek süspansiyondaki hematopoetik hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 400 G'de yedi dakika boyunca pelletleyin. Son olarak hücreleri 21 gauge küt uçlu iğne kullanarak yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Hücreler artık yeniden ekime veya sonraki analizlerde kullanılmaya hazırdır.

ES M strawberry OP nine ko-kültür sistemi, belirtilen hematopoetik gelişimi modellemek için kullanılabilir. İşte, farklılaşmış ES progeny'lerinin yeni M strawberry OP nine hücrelerine aktarılması gereken günleri gösteren ko-kültür zaman çizelgesine genel bir bakış. ES hücrelerinin konfluen bir M strawberry OP nine hücre tabakası üzerinde uygun şekilde farklılaşması, flick one pozitif üretimi ile sonuçlanacaktır.

Ortak kültürün beşinci günündeki anjioblastlar. Hem osteoblastlar hem de endotelyal ve hematopoetik soy hatları için ortak mezodermal öncül hücrelerdir ve bu görüntüde gösterildiği gibi üst üste binmiş hücre kümeleri şeklinde görünmelidirler. Ortak kültür devam ederken altıncı veya yedinci günde iki ila dört hücreli kümeler ortaya çıkmalı ve daha büyük hücre kümelerine dönüşmelidir. Sekizinci veya dokuzuncu güne gelindiğinde hematopoetik öncüller mevcut olurken, terminal olarak farklılaşmış hematopoetik soy hatları 14. güne kadar ortaya çıkar.

Buna karşılık, uygun olmayan ESL farklılaşmasına sahip bir ko-kültür, beşinci günde dünya modelinde görünmeyen ES türevli progeny ile sonuçlanacaktır. Hücrelerin dünya modelinde bulunmaması, uygun olmayan GIO blast oluşumuna işaret eder. Uygun olmayan eblast oluşumuna sahip bir ko-kültür, nihayetinde hematopoetik soy farklılaşmasının engellenmesiyle sonuçlanacak olup bu modifiye ES OP nine ko-kültür protokolü ile birlikte imha edilmelidir.

ES kaynaklı progeniler m strawberry negatiftir ve M strawberry pozitif olanlardan akışla sıralanabilirler. Değerlendirme için ko-kültürün herhangi bir gününden dokuz hücre toplayın. Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar burada gösterilmektedir.

Daha önce yayınlanmış olan dokuz ES OP ko-kültür protokolü, yalnızca yapışmayan yüzer hücrelerin pasajlanmasına ve değerlendirilmesine odaklanmıştır. Bu modifiye protokolde, hem yapışkan hem de yapışmayan tüm ES türevli hücreler pasajlanır ve değerlendirilebilir. Bu durum, hematopoetik hücre veriminin artmasını sağlar, nadir hücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak tanır ve hem hematopoetik hem de hematopoetik olmayan tüm ES progenilerinin tam olarak karakterize edilmesini sağlar.