Name: Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar. (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinin hematopoietik soya hücrelere farklılaşmasını mStrawberry OP9 hücreleriyle ortak kültürde. Bu yöntem tüm ES türevi ürünlerin karakterizasyonunu sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz U. Ganapati mStrawberry OP9 hücre hattı kurulması ve test için teşekkür ederiz. Ayrıca, ko-kültür ile H. Shafifor ona yardım teşekkür ederim. HP, Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü (F31HL087714) (HP) bir arkadaş grubu tarafından desteklenmektedir. Bu çalışmanın içeriği yalnızca yazarın sorumluluğundadır ve Ulusal Kalp, Akciğer ve Kan Enstitüsü ve Ulusal Sağlık Enstitüleri (NIH) mutlaka resmi görüşlerini temsil etmemektedir. UCLA Sitometrisi Core Tesis NIH (CA-16.042 ve AI-28.697), Jonsson Kanser Merkezi, UCLA AIDS Enstitüsü ve UCLA Tıp Okulu tarafından desteklenmektedir.

1. ES hücrelerinin hazırlanması <ol><li> Özellikle hücre hattı için standart protokole göre, Kültür ES hücrelerinin. Gün 0 mStrawberry OP9 hücreleri üzerine plakası için yeterli ES hücrelerinin hazırlamak için emin olun (ES hücreleri Gün 0 cm 2 başına 1x10 ^ 3 hücre kaplama olacak) </li></ol> 2. OP9 hücrelerin hazırlanması <ol><li> Büyüyen mStrawberry OP9 hücreleri önce OP9 büyüme ortamı hazırlamak OP-9 Hücre Kültürü Orta <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Hisse senedi </td><td> Final kons. </td><td> Hacim (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS (OP-9 test) </td><td> % 100 </td><td> % 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> 100X (200mm) </td><td> 2mm </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50ml </td></tr></tbody></table> 4 ° C ve bir hafta içinde hazırlık Mağaza </li><li> MStrawberry OP9 hücreleri korumak için, medya, 2 günde değişti olmalıdır ve hücreler (% confluency 70-90 altkültürü) confluency ulaşan hücrelere önce pasajlandı olmalıdır. bu adipositlere farklılaşma sonucu olarak mStrawberry OP9 hücre kültürlerinde% 90 confluency hiç ötesinde büyüdü. Şekil 3'e bakın. <ol class="lalpha"><li> PBS (veya tripsin-EDTA ile PBS + 1x% 0.1 ile 1x) ile 2X yıkama hücreleri tarafından Altkültür hücreleri </li><li> 37 ° önceden ısıtılmış% 0.1 tripsin-EDTA ° C 5 dakika boyunca (veya hücreleri ayırarak kadar) </li><li> Hücreleri müstakil, OP-9 büyüme orta ekleyin. 50ml konik tüp hücreleri aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 300 xg'de Pelet hücreleri supernatant atın. </li><li> Taze mStrawberry OP9 büyüme ortamı içinde süspanse edin hücreleri </li><li> 10 4 hücre / cm 2, en az yoğunlukta Plaka hücreleri </li><li> Grow için gerekli ko-kültür ES hücreleri (0. Gün, Gün 5, ya da deney 8.Gün / 9) gün önce 3 gün başlayan confluency mStrawberry OP9 hücreleri </li></ol></li></ol> 3. ES / mStrawberry OP9 Co-kültür <ol><li> Co-kültür farklılaşmasını ortamı hazırlayın <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Hisse senedi </td><td> Son </td><td> Hacim (ml) </td></tr><tr><td> aMEM </td><td></td><td></td><td> 39,5 </td></tr><tr><td> FBS </td><td> % 100 </td><td> % 20 </td><td> 10 </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> 200mm </td><td> 2mm </td><td> 0,5 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 50ml </td></tr></tbody></table></li><li> mStrawberry OP9 hücreleri (Gün -3) <ol class="lalpha"><li> DAİMA Gün -3 OP9 hücreleri konfluent ko-kültür Günü 0 mStrawberry OP9 hücrelerinin katmanları var, böylece Altkültür. Bkz: Şekil 4b. Gün 0 'confluency için 1x10 4 / cm 2 Levha mStrawberry OP9 hücreleri. Gün 5 ve eş-kültür devamı için 8 / 9 Gün altkültürü ekstra hücrelere emin olun. </li></ol></li><li class="jove_content"> ES / mStrawberry OP9 ko-kültür Set-Up (Gün 0) <ol class="lalpha"><li class="jove_content"> 2x ES hücreler PBS ile yıkayın </li><li> Önceden ısıtılmış% 0.25 'lik tripsin-EDTA, inkübasyon ES hücrelerinin Trypsinize 5min @ 37 ° C </li><li> Co-kültür farklılaşmasını medya hücreleri ekle </li><li> Pelet ES hücreleri 400xg az, 5-7dk, RT. Süpernatant atın </li><li> Co-kültür farklılaşmasını medyada yeniden süspanse hücre </li><li> MStrawberry OP9 hücreleri medya kaldırma </li><li> MStrawberry OP9 şişeler Co-kültür farklılaşmasını Medya ekle </li><li> MStrawberry OP9 hücreleri balona Plaka 1x10 3 ES hücre / cm 2. 37 ° hücreleri ° C'de,% 5 CO 2 nem ile. </li></ol></li><li> mStrawberry OP9 hücreleri (2. Gün) <ol class="lalpha"><li> Altkültür mStrawberry OP9 konfluent ko-kültür 5. Gün mStrawberry OP9 hücrelerinin katmanları var. 5. Gün confluency için 1x10 4 / cm 2 Levha mStrawberry OP9 hücreleri (adım 3.2 'deki gibi). Gün 8 / 9, gerekirse (adım 2.2 'de olduğu gibi) için altkültürü ekstra hücrelere emin olun. </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (Gün 3) <ol class="lalpha"><li> Co-kültür dikkatlice orta kaldırmak ve Co-kültür farklılaşması orta taze ile değiştirin </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (5. Gün) <ol class="lalpha"><li> PBS ile 2x ortak kültürler dikkatlice yıkayın </li><li> Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA içeren hücreleri Trypsinize </li><li> Co-kültür farklılaşmasını medya ile şişeyi kapalı hücreler yıkayın </li><li> 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT supernatant atın </li><li>Hücrelere Co-kültür farklılaşmasını Medya ekle hücreleri tekrar süspansiyon haline getirin ve tek hücre süspansiyonu sağlamak için 21-gauge bluntended iğne kullanın </li><li> Hemasitometre kullanarak hücreleri saymak. Gün 0 ES hücre sayısı 100-150 kat artış olması gerekir. </li><li> Ynt tohumu 6.48x10 4 / cm 2 - birleşmiş, mStrawberry OP9 hücreler yeni bir katmana 7.76x10 4 / cm 2 ko-kültür hücreleri </li><li> 5. Gün Tahliller-ko-kültür hücreleri Kalan flow sitometri analizi, cytopreps (30K hücreleri), ChIP testleri, vb. </li></ol></li><li> ES / mStrawberry OP9 ko-kültür (Gün 8 / 9 ve 12 Gün) <ol class="lalpha"><li> Şişeyi ayırt medyayı çıkartın ve saklayın. Süspansiyon hematopoietik hücreleri çıkarmak için PBS ile yıkayın tek tabaka 1x hematopoetik hücreler dışarı atmak. </li><li> Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ile yapışık hücrelere Trypsinize </li><li> ES farklılaşma medya ile balon kapalı hücre yıkayın ve süspansiyon = bulunan hematopoietik hücreleri eklemek </li><li> 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT supernatant atın </li><li> Co-kültür farklılaşmasını medya veya PBS hücrelere ekleyin. Hücreleri tekrar süspansiyon ve hemasitometre kullanarak tek hücre süspansiyonu Sayısı hücrelerin sağlamak için 21-gauge bluntended iğne kullanın. </li><li> Co-kültür, 12 gün sonra tekrar yeni bir katman üzerine Gün 8 ya da 9 birleşik, mStrawberry OP9 hücreleri yeniden tohumlama ko-kültür hücreleri tarafından daha olgun hematopoietik atalarıdır değerlendirmek ve 14 gün süreyle devam edilebilir. Ynt tohumu gün tahlil için gerekli hücre kurtarma dayalı optimize edilmiş hücre sayısı. </li></ol></li><li> ES-kökenli döl (Gün 1-14) değerlendirilmesi. ES-türetilmiş döl mStrawberry negatif hücreler (ES-türetilmiş döl) sıralama akış eş-kültür her günü değerlendirilebilir. <ol class="lalpha"><li> Şişeyi ayırt medyayı çıkartın ve saklayın. PBS ile yıkayın tek tabaka 1x süspansiyon hematopoietik hücreleri çıkarmak için. Hematopoetik hücreler dışarı atmak değil. </li><li> Önceden ısıtılmış% 0.25 tripsin-EDTA ile yapışık hücrelere Trypsinize </li><li> Co-kültür farklılaşmasını medya ile yıkayın ve şişeyi kapalı hücre süspansiyon bulunan hematopoietik hücrelere </li><li> 400xg Pelet hücreleri, 7dk, RT. Süpernatant atın </li><li> 21-gauge bluntended iğne sayısı ile yeniden süspanse hücreleri </li><li> ES-kaynaklı döl (mStrawberry negatif hücreler) mStrawberry olumlu OP9 hücreleri sıralanır akışı olabilir. ES-kaynaklı döl sonra flow sitometri analizi, cytopreps, ChIP testleri, vb ile karakterize edilebilir </li></ol></li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. ES / mStrawberry OP9 Co-kültür Sistemi laboratuar model hematopoetik geliştirme in vitro ES hücre ko-kültür sistemi kullanır. Konfluent mStrawberry OP9 hücrelerinin bir katman üzerine yerleştirildiği zaman, bu ko-kültür sisteminde, ES hücreleri, gün5 hemangioblasts içine ayırt. Co-kültür ilerledikçe, hematopoietik öncüleri terminal farklılaşmış hematopoetik soy 14. Gün görünür, Gün 8 mevcuttur. Gerekli de mStrawberry OP9 hücrelerinin yeni konfluent katmanları üzerine ES-kökenli döl Pasajlanması zaman Oklar farklılaşma gün göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Uygun ES hücre Farklılaşma. Embriyonik kök hücrelerin, Gün 0 'mStrawberry OP9 konfluent tabakası üzerine numaralı seribaşı. ES-türetilmiş döl ES-kökenli döl tanımlanmış bir sınır ile bir hücre kümesi gibi görünen veya bir girdap desen oluşmaya başlayan farklılaşma 3. Gün görünür hale başlar. Gün 5 hücre loca yığılmış olarak endotel ve hematopoetik soy için ortak mezodermal habercisi Hemangioblasts, görünmelidir. Co-kültür beş gün daha uzun süreler için, ES-türetilen döl hematopoetik hücre kümeleri gibi görünmelidir. Iki ila dört hücreli kümeler, 6 / 7 Gün görünmelidir ve co-kültür Günü 8 / 9 tarafından büyük bir hücre kümeleri içine büyümek. Diğer ES türetilen döl sıkıca yapışık stromal hücre katmanı bağlı bulunmaktadır. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Bu ko-kültür Başarısız ES hücre farklılaşması. Sonuçları uygunsuz ES hücre farklılaşması yansıtmaktadır. ES-kaynaklı döl 5. Gün bir girdap desen görünmüyor nasıl unutmayın. Bir girdap desen hücrelerin yokluğunda yanlış hemangioblast oluşumu gösterir. Hemangioblast düzgün geliştirmek değilseniz, sonra ko-kültür bodur hematopoetik soy farklılaşma neden olacaktır. Uygunsuz hemangioblast oluşumu ile birlikte kültürler atılmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. mStrawberry OP9 hücre kültürleri (A) mStrawberry OP9 hücre pasajlandı.Confluency 70-90%. (B) uygun farklılaşması için, ES hücreleri ve ES-türetilen döl mStrawberry OP9 hücrelerinin aşırı konfluent bir tabaka üzerine yerleştirilir. <img src="/files/ftp_upload/2559/2559fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Temsilcisi ES / mStrawberry OP9 Co-kültür akış profili. ES-kökenli döl mStrawberry negatif hücreler ve mStrawberry OP9 hücrelerden sıralaması akışı olabilir. mStrawberry negatif hücre kapısı geleneksel bir ES/OP9 ko-kültür kullanılarak tespit edildi.

<ol><li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+origins+of+mammalian+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Embryonic origins of mammalian hematopoiesis.</a> Exp Hematol. 31, 1160-1160 (2003).</li>
<li>Baron, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+patterning+of+the+mouse+embryo%3A+implications+for+hematopoietic+commitment+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Hematol%22%5BJournal%5D)">Early patterning of the mouse embryo: implications for hematopoietic commitment and differentiation.</a> Exp Hematol. 33, 1015-1015 (2005).</li>
<li>Baron, M. H., Fraser, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+specification+of+early+hematopoiesis+in+the+mammal%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Hematol%22%5BJournal%5D)">The specification of early hematopoiesis in the mammal.</a> Curr Opin Hematol. 12, 317-317 (2005).</li>
<li>Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryoid+bodies%3A+an+in+vitro+model+of+mouse+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Embryoid bodies: an in vitro model of mouse embryogenesis.</a> Exp Physiol. 85, 645-645 (2000).</li>
<li>Ganapati, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+notch+signaling+in+normal+and+neoplastic+hematopoiesis%3A+global+gene+expression+profiling+in+response+to+activated+notch+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Modeling notch signaling in normal and neoplastic hematopoiesis: global gene expression profiling in response to activated notch expression.</a> Stem Cells. 25, 1872-1872 (2007).</li>
<li>Hogan, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHogan%2C+B+%22Manipulating+the+mouse+embryo+%3A+a+laboratory+manual%22">Manipulating the mouse embryo : a laboratory manual</a>. , 2nd ed, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, N.Y. (1994).</li>
<li>Keller, G., Kennedy, M., Papayannopoulou, T., Wiles, M. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+commitment+during+embryonic+stem+cell+differentiation+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic commitment during embryonic stem cell differentiation in culture.</a> Mol Cell Biol. 13, 473-473 (1993).</li>
<li>Keller, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">In vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Curr Opin Cell Biol. 7, (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphohematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lymphohematopoietic development from embryonic stem cells in vitro.</a> Semin Immunol. 7, 862-862 (1995).</li>
<li>Nakano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+development+of+hematopoietic+system+from+mouse+embryonic+stem+cells%3A+a+new+approach+for+embryonic+hematopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Hematol%22%5BJournal%5D)">In vitro development of hematopoietic system from mouse embryonic stem cells: a new approach for embryonic hematopoiesis.</a> Int J Hematol. 65, 1-1 (1996).</li>
<li>Nakano, T., Kodama, H., Honjo, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+lymphohematopoietic+cells+from+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of lymphohematopoietic cells from embryonic stem cells in culture.</a> Science. 265, 1098-1098 (1994).</li>
<li>Turksen, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTurksen%2C+K+%22Embryonic+stem+cells+%3A+methods+and+protocols%22">Embryonic stem cells : methods and protocols</a>. , Humana Press. Totowa, N.J. (2002).</li>
</ol>

Eş-kültür Gün 5 Flk1 + hemangioblasts üretiminde mStrawberry OP9 hücreleri sonuçları konfluent katman üzerinde ES hücrelerinin doğru farklılaşma. Hemangioblasts Şekil 1&#39;de görüldüğü gibi hücre loca gibi yığılı görünmelidir. Co-kültür geri kalanı için, görünür ES-türetilen döl hematopoetik hücre kümeleri (Şekil 1) olarak görünmelidir. Gün6 7 / 03:58 hücre kümeleri görünmelidir ve co-kültür Günü 8 / 9 büyük bir hücre kümeleri (yapışık ve süspansiyon) içine büyümeye. Diğer ES türetilen döl sıkıca yapışık stromal hücre katmanı içinde bağlı bulunmaktadır. Protokolde yer olmasa da, FBS ES büyüme ortamı, mStrawberry OP9 büyüme ortamı ve ES / mStrawberry OP9 farklılaşma medya kullanılan ön test için kritik öneme sahiptir. Düzgün serum ko-kültür uygun mStrawberry OP9 hücrelerinin büyüme yanı sıra, ES hücreleri düzgün farklılaşma farklılaşma Gün 5 kadar emin olmalıdır test edilmiştir. MStrawberry OP9 hücrelere ek olarak, alternatif olarak veya OP9 hücreleri (7.8x10 4 hücre / cm 2) confluency ekim öncesinde, 8000 rad, ışınlanmış olabilir. OP9 hücreleri ışınlanması downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden olan, neredeyse tamamen ortadan kaldırılması için eski sağlar yanı sıra, tekrarlanan replating adımları ortadan kaldırılması için izin verir. OP9 hücreleri CMV organizatörü (pRRLsin CMV vektör, UCLA vektör çekirdek) kontrolü altında bir lentiviral vektör ifade mStrawberry 3ug/mL OP9 hücreleri uyum mStrawberry protein ifade etmek için tasarlanmıştır. Standart ES/OP9 ko-kültür protokolleri yanı sıra, OP9 hücreleri hücre geçit kirlenmesine, eski azaltmak amacıyla, bir konfluent katmanı OP9 hücreleri üzerine bir gün 5 replating adım ES hücrelerinin yerleştirilmesi gerektirecektir. Ayrıca, sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücreler ES-kökenli döl değerlendirilmesi için kaldırılır. Ancak, bir replating sadece süspansiyon hücrelerinin adım ve hasat ile bir potansiyel, gelişmekte olan önemli sayıda ES-kaynaklı hematopoetik hücreler özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Bu sorunu aşmak için amacıyla laboratuvar OP9 hücreleri mStrawberry ifade kullanımı yoluyla değiştirilmiş bir ko-kültür kullanılır. Bu tüm ES döl 5 gün devam eden ko-kültür transfer olmasını sağlar, aşağı testleri için tüm ES-türetilen döl hasat için. Bu değişiklik, değerlendirme ve karakterizasyonu, insan ve fare ES hatları türetilen hematopoietik döl yararlı araçlar sağlar. Çeşitli aşamalarında, ilkel ve kesin hematopoez Bu ES-mStrawberry OP9 ko-kültür modeli özetlediği. Hematopoetik gelişiminin erken evrelerinde incelerken, birçok kişi, ES hücre hemangioblast gelişimini değerlendirmek, BL-CFC (koloni oluşturan hücre Patlamaya gibi) testi kullanır. BL-CFC testinin erken hematopoetik gelişimi araştıran yararlı bir araçtır hemangioblast değerlendirilmesi yanı sıra, daha yetişkin hematopoetik soy sağlar mStrawberry-ES, ko-kültür sistemleri artış yardımcı programı sergiler. Için, HoxB4, aşırı ekspresyonunun gibi, belki de gerekli ek faktörler hematopoietik kök hücrelerinin in vitro repopulating uzun vadeli elde etmek için, geleneksel OP9/ES ve EB farklılaşma protokolleri kullanarak Önceki iş göstermiştir. Ek iş mStrawberry negatif, ES-kökenli nüfus sıralaması doğru hematopoietik kök hücreleri içeren olup olmadığını değerlendirmek için gereklidir.

OP-9 Hücre Bakım Orta Stok Bileşenleri <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Omega Bilimsel </td><td> FB01 </td><td> Önceden-Tested </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200 nm </td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Stem Hücre Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table> ES/OP-9 Hücre Farklılaşma Orta Stok Bileşenleri <table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> aMEM </td><td> Invitrogen </td><td> 12571-063 </td><td></td></tr><tr><td> FBS </td><td> Hyclone </td><td> SH30070 </td><td> Önceden-Tested </td></tr><tr><td> L-glutamin </td><td> Cellgro </td><td> 25-005-CI </td><td> 200mm </td></tr><tr><td> PBS (+ ve Mg 2 + Ca 2 olmadan) </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-CV </td><td></td></tr><tr><td> Tripsin-EDTA </td><td> Stem Hücre Teknolojileri </td><td> 07901 </td><td></td></tr></tbody></table>

modifiye es / op9 co-kültür protokolü hematopoetik döl geliştirilmiş karakterizasyonu sağlar.

Modified ES / OP9 Co-Culture Protocol Provides Enhanced Characterization of Hematopoietic Progeny

In vivo ve embriyonik lethalities ile uğraşmak zorunda kalmadan, hematopoez dahil erken genleri tanımlamak için ulaşılması zor olan hücre popülasyonlarının çalışılırken, hematopoetik hücre kaderinin doğru ES hücrelerinin in vitro farklılaşması yararlıdır . OP9 stromal hücre hattı M-CSF fonksiyonel eksikliği osteopetrosis mutant farelerin calvaria türetilen ES/OP9 ko-kültür sisteminin ilk olarak makrofajların aşırı üretim olmadan, hematopoetik döl üretmek için dizayn edilmiştir. In vitro ES/OP9 ko-kültür sisteminde erken hematopoetik gelişimi özetlemek amacıyla kullanılabilir. OP9 stromal hücrelerinin kültüre, ES hücreleri FLK-1 + hemangioblasts, hematopoetik atalarıdır ve nihayet olgun, terminal farklılaşmış soy farklılaşırlar. Standart ES/OP9 ko-kültür protokolü OP9 hücrelerinin konfluent tabakası üzerine ES hücrelerinin yerleştirme gerektirir; OP9 hücreleri kirlenmesine neden olan, eski kaldırmak için yanı sıra, periyodik replating adımları. Ayrıca, mevcut protokolleri sadece süspansiyon bulundu hematopoetik hücrelerin değerlendirilmesi ve farklılaşma her gün ES-kökenli döl değerlendirilmesi için optimize edilmiş değildir. Ancak, adımları ve sadece süspansiyon hücrelerinin hasat replating bir potansiyel ES-kökenli döl ve hematopoietik hücreleri gelişmekte olan büyük bir bölümünü özlüyor. Bu sorun, nakavt ES hatları ile ilgili hematopoetik kusurları karakterize etmek için çalışırken ele almak önem kazanmaktadır. Burada downstream deneyleri OP9 hücre kirlenmesine neden ortadan kaldırılması için izin veren bir değiştirilmiş ES / mStrawberry OP9 ko-kültür, açıklar. Bu yöntem, embriyo içinde gözlenen hematopoetik farklılaşma desen daha doğrudan karşılık gelen bir hematopoetik farklılaşma desen, tam bir değerlendirme için, eş-kültür her gün tüm ES-türetilen döl verir.

mStrawberry OP9 hücreleri ko-kültür tüm ES-türetilen döl tam değerlendirme için izin verir.

Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

ES hücrelerinin in vitro ortamda hematopoetik hücre kaderine doğru farklılaştırılması, in vivo ortamda erişilmesi zor olan hücre popülasyonlarını incelemede faydalıdır...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, fare embriyonik kök hücrelerini çeşitli primitif ve definit hematopoetik soy hücrelerine farklılaştırmaktır. Tüm ES hücre progenilerini karakterize etmek için fare hematopoetik hücre farklılaştırması, ES hücrelerinin konfluens halindeki floresan işaretli M strawberry OP nine stromal hücre tabakasına yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Farklılaştırmanın veya ko-kültürün her bir günü, uygun hasat zamanındaki hematopoetik gelişimin çeşitli aşamalarını temsil eder.Farklılaşmış ES hücre türevleri, hücre ayırma yöntemiyle M strawberry OP nine stromal hücre hattından ayrılabilir. Bu ES farklılaşma protokolü, in vivo gözlemlenen primitif ve definit hematopoiezi yeniden oluşturur ve embriyo kullanımı gerekmeksizin, knockout ES hücre hatlarıyla ilişkili hematopoetik defektlerin karakterizasyonunda kullanılabilir. Merhaba, UCLA'in Johnson Kapsamlı Kanser Merkezi'ndeki Dr. Judith Gassen'in laboratuvarına hoş geldiniz.Benim adım Alicia Poz. Bugün size göstereceğim tekniğin mevcut ESO nine ko-kültür yöntemlerine göre temel avantajı, bu prosedürün tüm beşinci ve sekizinci gün hücrelerinin pasajlanmasına ve tüm ES türevli progenylerin tamamen ayrıştırılmasına olanak tanımasıdır. Dokuz stroma M strawberry OP nine hücreleri, her iki günde bir değiştirilmesi gereken OP nine hücre kültürü ortamında büyütülür.OP9 hücreleri, ko-kültür için ihtiyaç duyulmadan üç gün önce pasajlanmalıdır. Bakım sırasında OP9 hücrelerinin yoğunluğunun asla %90 konfluensin üzerine çıkmaması gerektiği unutulmamalıdır. İlk olarak hücreleri iki kez PBS ile yıkayın, ardından ön ısıtılmış 0.1% tripsin EDTA ekleyip beş dakika bekleyin. Hücreler ayrıldığında, OP9 hücre kültür ortamı ekleyin ve hücreleri 50 mL'lik konik tüpe aktarın.Santrifüjden sonra hücreleri oda sıcaklığında 300 G'de beş dakika boyunca tüpte peletleyin, süpernatanı uzaklaştırın ve hücreleri taze M strawberry OP nine hücre kültürü ortamında yeniden süspande edin; ko-kültür deneyinin başladığı gün hücreleri santimetrekare başına minimum 10⁴ hücre yoğunluğunda plaka edin. Üç gün önce pasaja alınmış olan OP nine hücreleri konfluen olmalıdır. ES hücreleri, kullandığınız spesifik hücre hattı için standart protokole göre kültüre edilmelidir.ES hücrelerini iki kez PBS ile yıkayın, 0,25% trypsin EDTA ile tripsinize edin ve 37 °C'de beş dakika inkübe edin. Ardından, ES hücrelerine ko-kültür diferansiyasyon medyumu ekleyin ve hücreleri 15 ml'lik konik tüplere aktarın. ES hücrelerini oda sıcaklığında, 400 g'de beş ila yedi dakika boyunca pelletleyin.Süpernatant uzaklaştırıldıktan sonra ES hücrelerini ko-kültür farklılaşma ortamında yeniden süspande edin. Tek hücreli bir süspansiyon elde etmek için 21 gauge küt uçlu iğne kullanın. Hücreleri tripan mavisi ve bir hemositometre kullanarak sayın.Şimdi M çilek flaskını geri alın. İnkübatörden OP nine hücrelerini çıkarın. OP nine hücrelerindeki medyumu uzaklaştırın ve flask plakasına ko-kültür farklılaşma medyumu ekleyin.Her bir M strawberry OP nine hücreli flaska santimetrekare başına 1×10³ ES hücresi ekleyin; hücreleri 37 °C'de, %5 karbondioksit ve nem altında inkübe edin. Bu gün sıfırdır ve ko-kültür bu şekilde görünmelidir. ES M strawberry OP nine ko-kültürünün başlangıcından üç gün sonrası.Çoğunlukla belirgin sınırlara sahip, ES kaynaklı progeniden oluşan büyük düz kümeler gözlemlenir ve bazı hücre girdapları oluşmaya başlamış olacaktır. Ko-kültürün başlamasından beş gün sonra, ortamı ko-kültürden dikkatlice uzaklaştırın ve taze farklılaşma ortamı ile değiştirin. Konfluent bir M strawberry OP nine hücre tabakası üzerinde ES hücrelerinin uygun şekilde farklılaşması, üst üste binmiş hücre dünyaları şeklinde görünen hematoblastlar ile sonuçlanmalıdır.Bu prosedürün en kritik yönü, ko-kültürün beşinci gününde uygun farklılaşmayı sağladığınızdan emin olmaktır. Bu noktada, insan blastosist kolonilerini sadece mikroskobik olarak değil, makroskobik olarak da görebilirsiniz. Ko-kültürü PBS ile iki kez dikkatle yıkayın ve hücreleri %0,25 tripsin EDTA ile tripsinizize edin, hücreleri ES farklılaşma medyası ile flasktan yıkayarak bir tüpe aktarın ve oda sıcaklığında yedi dakika boyunca 400 G'de santrifüj ederek pelletleyin.Santrifüjden sonra süpernatantı uzaklaştırın ve yeni besiyeri ekleyin. Ardından, hücreleri yeniden süspanse etmek için 21 gauge küt uçlu bir iğne kullanın ve tek hücre süspansiyonu sağlandığından emin olmak için hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın; sıfırıncı günden itibaren ES hücre sayısında 100 ila 150 katlık bir artış olmalıdır. Sekizinci veya dokuzuncu günde, ko-kültür hücrelerini konfluen M strawberry OP nine hücrelerinin yeni bir tabakasına yeniden ekin ve 12. günde hücreleri tekrar sayın. Hematopoetik hücreleri içeren besiyerini uzaklaştırın ve saklayın.Süspansiyondaki hematopoetik hücreleri uzaklaştırmak için tek katmanlı tabakayı bir kez PBS ile yıkayın ve hücreleri saklayın. Tripsin ile yapışan hücreleri flasktan uzaklaştırmak için flaska %0,25 tripsin EDTA ekleyin; hücreleri ES diferansiyasyon medyası ile yıkayıp flasktan sökerek süspansiyondaki hematopoetik hücrelere ekleyin. Hücreleri oda sıcaklığında 400 G'de yedi dakika boyunca pelletleyin. Son olarak hücreleri 21 gauge küt uçlu iğne kullanarak yeniden süspanse edin ve hücreleri sayın. Hücreler artık yeniden ekime veya sonraki analizlerde kullanılmaya hazırdır.ES M strawberry OP nine ko-kültür sistemi, belirtilen hematopoetik gelişimi modellemek için kullanılabilir. İşte, farklılaşmış ES progeny'lerinin yeni M strawberry OP nine hücrelerine aktarılması gereken günleri gösteren ko-kültür zaman çizelgesine genel bir bakış. ES hücrelerinin konfluen bir M strawberry OP nine hücre tabakası üzerinde uygun şekilde farklılaşması, flick one pozitif üretimi ile sonuçlanacaktır.Ortak kültürün beşinci günündeki anjioblastlar. Hem osteoblastlar hem de endotelyal ve hematopoetik soy hatları için ortak mezodermal öncül hücrelerdir ve bu görüntüde gösterildiği gibi üst üste binmiş hücre kümeleri şeklinde görünmelidirler. Ortak kültür devam ederken altıncı veya yedinci günde iki ila dört hücreli kümeler ortaya çıkmalı ve daha büyük hücre kümelerine dönüşmelidir. Sekizinci veya dokuzuncu güne gelindiğinde hematopoetik öncüller mevcut olurken, terminal olarak farklılaşmış hematopoetik soy hatları 14. güne kadar ortaya çıkar.Buna karşılık, uygun olmayan ESL farklılaşmasına sahip bir ko-kültür, beşinci günde dünya modelinde görünmeyen ES türevli progeny ile sonuçlanacaktır. Hücrelerin dünya modelinde bulunmaması, uygun olmayan GIO blast oluşumuna işaret eder. Uygun olmayan eblast oluşumuna sahip bir ko-kültür, nihayetinde hematopoetik soy farklılaşmasının engellenmesiyle sonuçlanacak olup bu modifiye ES OP nine ko-kültür protokolü ile birlikte imha edilmelidir.ES kaynaklı progeniler m strawberry negatiftir ve M strawberry pozitif olanlardan akışla sıralanabilirler. Değerlendirme için ko-kültürün herhangi bir gününden dokuz hücre toplayın. Temsili bir deneyden elde edilen sonuçlar burada gösterilmektedir.Daha önce yayınlanmış olan dokuz ES OP ko-kültür protokolü, yalnızca yapışmayan yüzer hücrelerin pasajlanmasına ve değerlendirilmesine odaklanmıştır. Bu modifiye protokolde, hem yapışkan hem de yapışmayan tüm ES türevli hücreler pasajlanır ve değerlendirilebilir. Bu durum, hematopoetik hücre veriminin artmasını sağlar, nadir hücre popülasyonlarının tanımlanmasına olanak tanır ve hem hematopoetik hem de hematopoetik olmayan tüm ES progenilerinin tam olarak karakterize edilmesini sağlar.

modified-es-op9-co-culture-protocol-provides-enhanced

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol detayları fare embriyonik kök hücreler (ESC) ve ölümcül ışınlanmış alıcı farelere sonraki enjeksiyon transplante hematopoietik kök hücre türetme. Kısaca ESC embriyoid organları, sonra retroviral HoxB4 ve OP9 stromal hücreler ve hematopoetik sitokinlerin birlikte kültürlü ile enfekte olarak ayırt edilirler.

Murin Embriyonik Kök Hücre Hematopoetik Kök Hücre türetilmesi

Sitometrisi kemik iliği hematopoietik öncü dağıtımı yanı sıra verimli yalıtmak için son derece saf hematopoetik kök hücreleri (HKH'ler) analiz etmek için bir yöntem tarif edilir. İzolasyon ^ işleminde esas olarak hücresel ve moleküler çalışmalar için HKH'ler arındırmak için sıralama c-Kit + hücreleri ve hücre manyetik zenginleştirme dayanmaktadır.

Mürin Hematopoetik Kök Hücreler ve Lineage-kararlı progenitörlerin Fenotipik Analizi ve İzolasyon

Bu videoda, kemik iliği mikroçevresi ile etkileşimlerini incelemek için lösemi hücrelerinin kemik iliği stromal hücreleriyle uzun süreli 2D ko-kültür tekniği açıklanmaktadır. 2D kokültür modeli, akut lenfoblastik lösemi hücrelerini ve tümör hücresi fenotipini etkileyen kemik iliği stromal veya osteoblastlarını kullanır. Bu çalışma, kemoterapi maruziyeti sırasında lösemik hücrelerin kemik iliği destekli sağkalımının altında yatan mekanizmaların araştırılmasını destekleyecektir.

Lösemik Hücrelerin BMSC'lerle 2 Boyutlu Ko-kültürü: Lösemik Hücrelerin Alt Popülasyonlarını Elde Etmek İçin Bir Yöntem

Fare embriyonik kök hücreleri, OP9-DL1 ko-kültür sistemi kullanılarak in vitro olarak T hücrelerine farklılaştırılabilir. Bu prosedürde başarı, reaktif/hücre bakımına ve tekniğe duyarlı temel adımlara dikkat edilmesini gerektirir. Burada bu kritik parametreleri tartışıyor ve bu teknolojinin benimsenmesini teşvik etmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

T hücrelerinin türetilmesi İn Vitro Fare Embriyonik Kök Hücreleri

Ölümsüzleştirilmiş multipotent otik progenitör (iMOP) hücreleri ve otik farklılaşmayı sürdürmek için mevcut protokoller açıklanmıştır.  Duyusal epitel ve spiral ganglion nöronlarına (SGN) farklılaşmayı gösteren kültür koşulları ve moleküler belirteçler vurgulanır.

Ölümsüzleştirdi Multipotent Otic Progenitor Hücrelerde Farklılaşma başlatılıyor

Burada, insan pluripotent kök hücre (hPSC) kültür hPSCs CD34 ayırt etmek için kullanılan iletişim kuralları, mevcut+ hematopoetik ataları. Bu yöntem kurallı WNT ya kesin veya ilkel hematopoetik program sadece hücrelere belirtmek sinyal manipülasyon sahne özgü kullanır.

İlkel ve kesin hematopoetik ataları insan Pluripotent kök hücrelerden farklılaşma yönetmen

Miktar donör türetilmiş hücre engraftment kök hücre transplantasyonu hastalarında Hemoglobinopati sonra izlemek için gereklidir. Akış Sitometresi tabanlı cep sıralama, koloni oluşumu tahlil ve ataları erythroid yerde farklılaşma ve sonraki analizi kısa tandem tekrarlar yayılması değerlendirmek için kullanılabilir bir arada.

Hematopoetik kök hücre transplantasyonu Hemoglobinopati olan hastalar için sonra kalan donör Erythroid progenitör hücre algılama

Bu iletişim kuralı kültürlü aort-erbezi-Mesonephros ifade analizleri, koloni oluşturan birimlerinde kültür ve dalak ve uzun vadeli sulandırma için düzenleyici faktörler ve sinyal yolları hematopoetik kök üzerindeki etkisini belirlemek için kullanılmasını açıklar hücre gelişimi. Bu hematopoetik kök hücre biyolojisi ve işlev çalışmak için etkili bir sistem olarak göstermiştir.

Aorta-erbezi-mesonephros Explant kültür gelişimsel Hematopoiesis sistemde uygulanması

Biz nasıl tanımlanmasını ve yalıtılmasını miyeloid ataları fare kemik iliği bir manyetik kombinasyonu ve floresan (MAC'ler ve FACS) sıralama kullanarak üzerinden 6 alt kümelerini göstermek. Bu iletişim kuralı vitro kültürü deneyleri (methylcellulose ya da sıvı kültürleri), in vivo evlat edinen transfer deneyler ve RNA/protein analizleri için kullanılabilir.

Kimlik ve yalıtım Oligopotent ve Lineage için kabul edilen miyeloid ataları fare kemik iliği dan

Bu protokol, hasta kemik iliği ve periferik kan mononükleer hücrelerinden türetilen insan hematopoietik kök ve progenitor hücrelerinin farklılaşmasını sağlamak için bir prosedürü açıklar. Test, eritroid ve miyeloid soy bağlılığını destekleyen yarı katı bir kültür ortamı kullanır ve preklinik ilaç karakterizasyonu için tekrarlanabilir koloni sınıflandırması için standart metrikler içerir.

Koloni Oluşturan Birim Testi Hastadan Kaynaklanan Kemik Iliği ve Çevresel Kan Mononükleer Hücreler İçin Uyarlanmış

Keşfedin fare embriyonik kök hücrelerinin hematopoietik soya hücrelere farklılaşmasını mStrawberry OP9 hücreleriyle ortak kültürde. Bu yöntem tüm ES türevi ürünlerin karakterizasyonunu sağlar.

Modifiye ES / OP9 Co-Kültür Protokolü Hematopoetik Döl Geliştirilmiş Karakterizasyonu sağlar.

Daha fazla video keşfet