Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Benim adım Allison Clavon. Teksas, San Antonio'daki UT Health Science Center bünyesindeki Gree Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'nde Dr. Alex Bishop'un araştırma asistanıyım. Bugün, retinal pigment epitelyumun tamamını elde etmek için bir kemirgen gözünün nasıl diseke edileceğini göstereceğim.

Bu doku, retinal gelişim ve hastalıkların incelenmesi açısından önem taşımakta olup aynı zamanda in vivo homoloji yönlendirmeli DNA onarım analizinin gerçekleştirildiği bölgedir. Öyleyse başlayalım. Burada diseksiyona hazır bir göz bulunmaktadır.

Öncelikle, prosedür boyunca referans noktası olarak kullanacağınız anatomik yapılara bir göz atalım. Bu, seyreltilmiş bir hayvandan alınan gözdür. İşte gözün arkasında, karşı tarafta yer alan optik sinir.

Bu korneadır. İris, korneanın arkasından görünür. Gözün arkasındaki beyaz bölge ise skleradır.

Bu nedenle, bu bölge kornea skleral sınır olarak adlandırılır. Diseksiyonun ilk adımı, kas bağ dokusu ve optik sinir gibi yabancı dokuların uzaklaştırılmasıdır. Ardından, dairesel bir kesi yapılarak kornea çıkarılmalıdır.

Bu aşamada lens çıkarılarak içi boş bir göz çanağı elde edilebilir. Ardından, kornea-sklera sınırından optik sinir başına doğru dört kesi yapılır. Ortaya çıkan yapı dört taç yapraklı bir çiçeğe benzer.

Bu dört taç yaprağın her biri daha sonra ortadan kesilerek sekiz yapraklı bir çiçeğe benzeyen bir yapı elde edilir. Bu aşamada, küresel yapısı nedeniyle belirli bölgelerde bükülmeler meydana gelebilir. Bunu önlemek ve daha düz bir delik montajı sağlamak için bükülmenin olduğu noktaları hafifçe geçen sekiz kısa kesik atabilirsiniz.

Çalışma alanınızda 100 veya 200 µL pipet ve uygun uçları, bir adet 35 mm X-P-B-S-A kap, lam ve lameller, lam hazırlığı için %90 gliserol ve şeffaf oje, lamları kurutmak için bir raf, bir kutu Kim wipes ve bir atık konteyneri dahil olmak üzere çeşitli malzemelerin elinizin altında olması gerekir. Bu yaygın malzemelere ek olarak; diseksiyon boyunca gözü tutmak, çevirmek ve genel olarak manipüle etmek için kullanılan düz pensetler ve 45 derece açılı pensetler dahil olmak üzere bir set özel mikrodisseksiyon aracına da ihtiyacınız olacaktır. 15 derecelik bu pensetler yukarı doğru bir açıya sahiptir ve gözün tutulması ve manipülasyonu için kullanılırlar.

Son olarak, bir çift yaylı makasa ihtiyacınız olacak. Geleneksel tarzda makaslar yerine yaylı makas kullanmanız çok önemlidir. Bu diseksiyon için, diseksiyona başlamadan önce, dik oturduğunuzda gözlerinizin okülerlerle aynı seviyede olacağı şekilde sandalye yüksekliğinizin ayarlandığından emin olun.

Mikroskop başında kambur durmak omuz ve sırt ağrılarına yol açar ve diseksiyonlarınızın kalitesini düşürür. Başlamak için 35 milimetrelik kabın kapağına bir miktar XPBS dökün. Ardından, diseksiyon yapmayı planladığınız gözleri kabın içine aktarın.

Bu, yaban tipi bir C 57 siyah faresinden alınan bir gözdür. Çapı yaklaşık üç buçuk milimetre ile oldukça küçük olduğunu görebilirsiniz. Sklera opasitesi, göze mavimsi bir renk verir.

Diseksiyonun ilk adımı, kas bağ dokusu ve optik sinir gibi gözün etrafındaki tüm yabancı dokuların temizlenmesidir. Burada sol elimde 45 derecelik pens, sağ elimde ise 15 derecelik pens bulunmaktadır. Dokuları çekerken gözü sabitlemek için bir çift pens kullanabilirsiniz.

Büyük bir doku parçası ayrıldığında, pensetinizi bir Kim wipe ile dikkatlice silin. Gözü ezmemeye veya delmemeye özen gösterin. Bu diseksiyonun süspansiyon içinde gerçekleştirilmesinin faydalarından biri, gözden ayrılıp yüzen bağ dokusunu kolayca görebilmenizdir.

Sonunda, pensle daha fazla doku çıkaramadığınız bir noktaya geleceksiniz. 15 derecelik açılı pensinizi yaylı makasla değiştirin. Optik siniri kesmek için yaylı makası kullanın.

Dokuyu kornea sklera sınırına doğru ileri itmek için bıçağın dış kenarını kullanın. Ardından makasınızı düzeltin ve bir kim wipe ile nazikçe silin. Buna tekrar bakalım.

Doku yukarı doğru kalktığında, makasınızın dış kenarı ile dokuyu kornea sklera sınırına doğru ileriye itin. Kırpın; doku parçalarını makasınızın küt kenarıyla ileriye itmeye ve tüm yabancı dokular temizlenene kadar bunları kırpıp uzaklaştırmaya devam edin. Göz üzerinde genellikle iki şerit sert doku bulunur.

Birincisi kornea sklera sınırına tutturulmuştur ve ikincisinin kırpıldığı görülmektedir. Burası, kornea sklera sınırı ile optik sinir başının yaklaşık olarak orta noktasıdır. Diseksiyonun bir sonraki adımı kornea ve lensin çıkarılmasıdır.

Korneanın yaklaşık orta kısmında bir flebi kaldırmak için 45 derecelik pensinizi kullanın. Ardından, flebin tabanında küçük bir insizyon yapmak için yaylı makasınızı kullanın. Makasınızın alt bıçağını, iris altına doğru insizyondan içeri yerleştirin.

Kornea skleral birleşimine doğru, ancak içine girmeden bir kesi yapın. Şimdi, gözü yavaşça 360 derece döndürerek çevresine küçük kesiler yapın. Makası irisin altında tutmaya çalışarak hem korneayı hem de irisi aynı anda kesin.

Burada gösterdiğim kadar kolayca yapabilmek için çok fazla pratik yapmak gerekir. Kornea çıkarıldıktan sonra, gözü yan çevirin ve lensi dışarı iterek gözün dış kısmına hafifçe bastırın. Geriye kalan yapı bir çanağa benzeyecektir.

Göz dörde bölünmelidir. Bunun için gözü yan çevirin ve yaylı makasınızın alt bıçağını yerleştirin. Optik sinir başına doğru, ancak tam üzerine ulaşmayacak şekilde boylamsal bir kesi yapın.

Bunu yapmak için kollarınızı yanlarda tutun ve makasınızı vücudunuza ve göz kesiğine yaklaşık olarak dik olacak şekilde önünüzde konumlandırın. İkinci kesiğinizi doğrudan birinci kesiğin karşısına yapın. Pürüzsüz bir kesim yapabilmek için hizalama aşamasında acele etmeyin.

Birden fazla kesim yapmak tırtıklı kenarlara neden olabilir, ancak dikkatlice hizalandıklarında bunlar fark edilmez; göz normal şeklini koruduğu için gözün bu küresel yapısına karşı gelmek yerine onunla nasıl uyumlu çalışabildiğime dikkat edin. PBS içinde bekletildikten sonra, diseksiyonun geri kalanı bir lam üzerinde gerçekleştirilecektir. Gözü 45 derecelik açılı pensinizle kavrayın ve PBS'den dışarı çıkarın.

Gözü temiz bir lam üzerine yerleştirin. Her iki adet açılı pensi kullanarak gözü dikkatlice açın. Gözün çevresinde, tutmayı kolaylaştıran küçük bir kornea ve iris kenarı olduğu dikkat çekecektir.

Ardından, dört petalden her birini ortadan ikiye kesmeniz gerekir. Gözü, petallerden biri vücudunuza dik gelecek şekilde döndürün. Petalin köşesini 15 derecelik açılı pensetinizle kavrayın.

Hafifçe yukarı kaldırın ve ardından kornea skleral sınırından optik sinir başına doğru bir kesi yapın. Bu kesiler bir teğete dik olmalıdır. Teğet, çapa dik olan bir çizgidir.

Bu nedenle, yaptığınız kesikler gözün çapıyla aynı hizada olmalıdır. Şimdi, bir sonraki pedal vücudunuza dik olacak şekilde lamı döndürün ve işlemi tekrarlayın. Pedalın köşesini kavrayın.

Hafifçe kaldırın ve kesin. Dört büyük pedalın her biri ikiye bölünene kadar işlemi tekrarlayın. Beyazımsı madde, RPE'nin hemen üzerinde yer alan nöral retinadır.

Nöral retina, RPE'yi koruyabilir, bu nedenle tüm kesimleriniz tamamlanana kadar ona dokunmayın. Pedalların hafifçe kavisli olduğunu fark edin. Buna karşı zorlamayın.

Tek seferde düzgün bir kesim yapabilmek için hizalama işlemini acele etmeden gerçekleştirin. Göz yuvarlak olduğu için bükülme eğilimi gösterir; bu bükülmeyi önlemek için sekiz adet kısa kesik atabilirsiniz.

Her bir pedal üzerine bir adet. Önceki dört kesim turundaki temel stratejiyi uygulayın. Pedalın köşesini kaldırıp kesin, ancak bu durumda pedal uzunluğunun yalnızca yaklaşık yarısına kadar kesin.

Tüm kesimler tamamlandıktan sonra nöral retinayı çıkarabilirsiniz. Burada numuneye birkaç damla 1X PBS ekliyorum. RPE'nin kurumasını istemezsiniz.

Nöral retina, altındaki RPE ile sadece gevşek bir şekilde ilişkili olmalıdır. Oldukça kolayca ayrıldığını görebilirsiniz. Ancak, gözün iç kısmında siliyer cisim adı verilen tümsek bir sırt olan kornea-sklera ayrımında genellikle yapışık kalacaktır.

Nöral retinayı soyarken örneği sabitlemek için 15 derecelik pensetin ucunu optik sinir başına yerleştirebilirsiniz. Siliyer cisim, yerinden ayrılan koyu pigmentli doku olan RPE'nin kenarını belirler. Buradaki irisdir, RPE değildir.

İrisin mümkün olduğunca fazla kısmının çıkarılmasını öneririm; çünkü iris çok yapışkandır ve nöral retina pul pul dökülmüşse veya kalıntıları RPE'ye yapışık kalmışsa, katlanıp RPE'ye yapışabilir. Muhtemelen iki durumdan biri yanlış gitmiştir. Ya gözler, çok uzun veya çok kısa süre gibi uygun olmayan bir süreyle fiksasyon işlemine tabi tutulmuştur ya da diseksiyondan önce çok uzun süre depolanmışlardır.

Burada açığa çıkardığım pedal henüz kısayoluna sahip değildir. Pedalin, RPE kenarından yaklaşık üçte bir mesafe uzaklıkta olduğunu görebilirsiniz. Sekiz kısayolun önerilmesinin nedeni budur.

Nöral retinanın tamamı uzaklaştırıldıktan sonra, tüm toz ve kalıntılar temizlenene kadar bir pipet yardımıyla RPE'yi birkaç kez 100 ila 200 µL PBS ile durulayın. Temiz bir lam üzerine dikdörtgen şeklinde 80 ila 90 µL %90 gliserol ekleyin. Not: Bu hacim, 22 x 50 mm'lik bir lamel için optimal gliserol miktarıdır ve buna göre ayarlanmalıdır.

Diğer boyutlardaki lameller için gliserolü yaymak amacıyla pipet ucunuzu kullanın. Gliserole hava kabarcığı eklememeye dikkat edin. Eğer bir kabarcık oluşursa, onu patlayacağı kenara doğru sürükleyin.

15 derecelik pensetinizin alt kolunu RPE'nin altına kaydırın ve dikkatlice kaldırın, ardından RPE'yi yavaşça gliserolün içine indirin. RPE gliserolün üzerinde yüzecek ve hafifçe kıvrılabilir veya bükülebilir. RPE'yi düzeltmek ve gliserolü RPE'nin yüzeyine yaymak için pensetinizi kullanın.

Herhangi bir hava kabarcığı oluşursa, lamel camını yaklaşık 45 derece açıyla tutarak bu kabarcıkları, patlayacakları kenara doğru sürükleyin. Ardından lameli gliserolün kenarına değdirin.

Ardından lamın kenarına doğru hareket ettirin. Lamelin alt kısmını başparmağınız ve işaret parmağınızla tutun ve karşı kenarı 15 derecelik pensinizle destekleyin. Temas gerçekleşir gerçekleşmez lameli çok yavaş bir şekilde lama doğru indirin.

RPE ile birlikte indirmeyi durdurun, gliserolün yayılmasına izin verin ve ardından lamel camını yavaşça indirmeye devam edin. Lamel camını çok hızlı indirirseniz, lamelinize hava kabarcıkları girecektir. Gliserolün yayılmasını sağlamak için lamel camı RPE'ye temas ederken onu yavaşça indireceğim.

Lamı hızlıca bıraktığımda hava kabarcıklarının oluştuğunu görebilirsiniz. Lamel kenarını sabitlemek için bol miktarda şeffaf oje kullanın. Camı lama tüm çevre boyunca tamamen yapıştırın.

Bu, C 57 siyah faresinden alınan tipik bir RPE'dir. Burada belirtildiği gibi, alttaki damarlanmanın görülmesi normaldir. Ayrıca, daha az pigmente görünmüş yamalar gibi pigmentasyonda bazı farklılıkların görülmesi de normaldir.

Bununla birlikte, bu tür şeffaf lekelerin RPE ve altındaki koroidde meydana gelen fiziksel hasarlardan kaynaklanması muhtemeldir. Gözün koroid tabakası da pigmentli olduğundan, koroid sağlam kaldığı sürece siyah bir RPE'deki hasarın fark edilmemesi mümkündür.

Bu, dilüte bir fareden alınan tipik bir RPE'dir. Belirtildiği üzere, vaskülatürü görebilirsiniz ve daha koyu yamalar ile daha açık yamalar gibi pigmentasyonda bazı farklılıklar olacaktır. Ancak, dilüte bir RPE üzerinde hasarı görmek neredeyse imkansızdır.

Bu küçük yamalar hasar mı yoksa pigmentasyondaki normal varyasyonlar mı? Bu soruyu yanıtlamak için foid ve boyama yapılmasını öneririm. Bu, örneklere çok sert davranıp davranmadığınız konusunda size bir fikir verecektir.

Boyama, hücre membranlarını net bir şekilde belirginleştirerek hasarlı bölgeleri görünür kılar; ancak gerçekte RPE oldukça dayanıklıdır ve göze kornea kısmından tutarsanız hasar verme olasılığınız düşüktür. Burada, birçok sorun içeren bir bütün mont örneği görülmektedir; burada belirtilen en küçük sorun, kornea kenarının çok geniş bırakılmış olmasıdır ve bu durum kıvrımlı materyalin büzülmesine ve katlanmasına yol açabilir. Burada, gözün arka kısmında kalan çok büyük miktarda yabancı doku olduğunu görebilirsiniz.

Bu pedal kısmen katlanmış durumdadır ve burada RPE'nin kısmen yırtıldığını görebilirsiniz. Bir diğer sorun ise bu gözün rüzgar gülü görünümünde olmasıdır. Burada kesiklerin açılarını çizdim.

Ancak, olması gereken halこれが buydu. Unutmayın, kesimleriniz teğete dik ve çapla aynı hizada olmalıdır. Fare gözünün, retinal pigmentin bütün mount hazırlığı için nasıl diseke edileceğini göstermiş oldum.

Epitel doku çalışırken en önemli nokta doğru duruşu korumaktır, ancak gevşek kalmaya çalışın. Bu videoyu faydalı bulduğunuzu umuyor ve gelecekteki deneylerinizde size başarılar diliyorum.