Name: Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-27T16:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 47 s
Description: Öğrenin fare gözü diseksiyonu ile retinal pigment epiteli tüm mount preparasyonu tekniğini. Bu yöntem retinal gelişim ve hastalıklar üzerine nörobilim araştırmalarında temel oluşturur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Ulusal Çevre Sağlığı Bilimleri Enstitüsü tarafından desteklenen [K22ES012264 AJRB] ve Amerikan Kanser Derneği InstitutionalResearch Grant [ACS-IRG-00-173-04] Pilot projectaward [AJRB]. Biz yapmak için değil ne, örneğin, el yazması ve özellikle de video ve Adam Brown hakkında yorum eleştirel okuma Bishop laboratuar üyeleri de teşekkür ederim. Biz Greehey Çocuk Kanser Araştırmaları Enstitüsü&#39;nden Dr Donald McEwen diseksiyon video film çekimi için kamera set-up onun diseksiyon kapsam / video kullanımına izin verdiği için teşekkür ederim. Biz netlik ve mikrodiseksiyon araçları tamir Corte Aletleri Daron Brown teşekkür ederim.

1. Gözün dışında fazladan doku çıkarın <ol><li> 1X PBS 35mm çanak kapağı içine dökün. Seviyesi sadece kapağın dudak altında olmalıdır. </li><li> 35mm çanak depolama tüpü düz forseps, transfer göz (ler) kullanarak. 1: Gözler iki nedenden ötürü PBS batmış. Görmek ve onları kolayca kaldırmak ve 2, böylece gereksiz dokular göz "float". Diseksiyon sırasında asılı kalırken, gözün doğal olarak buna karşı ziyade bu şekli ile çalışmak için izin, küre şeklini koruyacaktır. </li><li> Açılı forseps (45 ° ve 15 °) her iki çifti kullanarak, hafifçe (kornea doğru yani) tahıl karşı doku çekerek, mümkün olduğu kadar çok kas ve bağ dokusu gibi çıkarın. Bazı bağ dokusu kalacaktır. Çaba mümkün olduğunca az göz küresinin sıkmak için yapılmalıdır. </li><li> Yaylı makas için 15 ° forseps Tic. 45 ° forseps ile göz sabit tutarken, kalan kas ve bağ dokusunun yanı sıra optik sinir kesip yaylı makas kullanın. * İpucu: Döşeme sonra tahıl karşı doku itmek için makas dış kenarına kullanın (corneo skleral bölmek doğru). Tüm yabancı doku, göz çıkarıldı kadar devam edin. </li></ol> 2. Kornea ve lens çıkarın <ol><li> Kornea yukarı bakacak şekilde, kornea merkezinde kat küçük bir çimdik 45 ° forseps kullanabilir. </li><li> Yaylı makas kullanılarak, flep tabanında küçük bir kesi yapmak. Flep gidelim. </li><li> Holding gözleri hala forseps düşük makas bıçak yerleştirin ve kesi dik ve corneo skleral bölmek doğru bir kesim yapmak. Alt bıçak, hem kornea ve iris kesilir, böylece, iris altında tutmak için çalışın. Corneo-skleral bölmek için tüm yol kesmeyin. Göz takılı makas tutun. </li><li> 45 ° forseps kullanarak, dikkatli bir makas corneo-skleral bölmek için paralel böylece göz döndürmek ve küçük bir kesim yapmak. Yavaş yavaş, etrafında küçük kesiler tüm yol, göz 360 ° döndürün. Yine, yaylı makas alt bıçak, iris ve kornea kesilir, böylece, iris altında tutmaya çalışın. Iris ve kornea gözün geri kalanı uzakta kaldırın ve atın. </li><li> Göz yan yatırın ve lens zorlayarak, gözün arka yarısında hafifçe bastırın. Lens atın. Kalan Göz yuvası içinde nöral retina, pürüzsüz ve mat görünmelidir kaplı olduğu. </li></ol> 3. Çeyrek 4 sonucu ortaya çıkan göz kapağı "petaled" çiçek gibi yapı <ol><li> Göz Göz yuvası açılması vücudunuza dik olacak şekilde yerleştirilmiş olmalıdır. 45 ° forseps, kararlı ve pozisyon Vizör adaptör kullanın. </li><li> Önünde yaylı makas Holding bu yüzden vücudunuza dik yaylı makas alt bıçak, açık göz fincan üst kenarına yerleştirin. 45 ° forseps kullanarak dikkatli bir şekilde, bir tek, düz kesim optik sinir başı doğru corneo-skleral ayrımı yapılabilir böylece göz fincan hizalayın. Tüm kesimler corneo-skleral bölmek için dik olmalı ve belirtilmediği sürece, içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın gitmek gerekir. </li><li> Vücudunuzun dikliğini koruyarak, Göz yuvası 180 ° döndürün. Ikinci bir dik kesim yapmak için 3.2 adımı tekniği kullanın. </li><li> Göz yuvası çevirin ve iki tane daha kesimler yapmak için 3.2 'de açıklanan tekniği tekrarlayın. Tüm dört kesimler dışında 90 ° mümkün olduğunca yakın olmalıdır. Bazı farklılıklar bulunmaktadır olacak kadar gözü mükemmel bir küre olmadığını aklınızdan çıkarmayın. </li></ol> 4. Sekiz yapraklı bir çiçek gibi bir yapı içinde, yarım her dört "yaprakları" Kes <ol><li> 35mm çanak temiz bir slayt dörde Göz yuvası aktarın. Göz yuvası yukarı bakacak şekilde, 45 ° forseps ile altında kepçe. Sıvı dikkatlice dışarı çıkarın ve temiz bir slayt üzerine yerleştirin. </li><li> Açılı forseps iki çifti kullanarak, yavaşça yukarı bakacak şekilde nöral retina ile göz açmak. ÇIKARMAYIN SİNİR Retina-buna karşı değildir bu yüzden göz küre şeklini bazı korumak yardımcı olur. Ayrıca, aşağıdaki yordamları kazara zarar görmesini RPE korur. </li><li> Slayt yaprakları bir vücudunuzun dik olana kadar çevirin. </li><li> 15 ° forseps yavaşça petal köşe kapmak. Petal köşesinde değil, nöral retina veya RPE kornea olmalıdır. Onun eğrilik korumak için izin köşesinde hafifçe yukarı kaldırın. </li><li> Petal ve slayt arasında yaylı makas alt bıçak yerleştirin. Makas kadar satır, bir tek, düz, dik kesme, optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek yapılabilir. Içine kesmeden optik sinir başı olarak mümkün olduğunca yakın kesin. Gidelimslaytta yalan sağlayan taç yaprağı. </li><li> Slayt 90 ° döndür, sonraki petal vücudunuza dik olacak şekilde. 4,5 adımı tekrarlayın. </li><li> Bunu iki kez daha adım 4.5 ve 4.6 tekrarlayın. Ortaya çıkan yapı, sekiz yapraklı bir çiçek gibi görünmelidir. </li></ol> 5. Nöral retina çıkarın <ol><li> Pipet 100-200 mcL numune üzerine 1X PBS. Bu nöral retinanın RPE soyulması gibi yapışmasını önleyecektir. </li><li> Genellikle nöral retina gevşek RPE eklenir. Ancak, sadece nöral retina ve RPE kaldırmak için uygulama ve beceri sürer. Açılı forseps diğer çift göz (basılı tutarak) geri kalanı stabilize bir çift açılı forseps ile yavaşça nöral retinanın bir taç yaprağı kavramak. Nöral retina gözün geri kalanı uzakta çekin. Tüm nöral retina kaldırıldı kadar bu işleme devam edin. * İpucu: göz çapa optik sinir başı 15 ° forseps ucu sopa. Sonra nöral retina altına süpürüyor 45 ° forseps kullanımı ve kapalı asansör ve. Nöral retina, corneo skleral bölmek doğru optik sinir başı kaldırmak için en iyi genellikle. Iris herhangi bir gevşek kalıntıları çekmeye emin olun. Iris oldukça yapışkan ve aksi RPE sıkışmış alabilirsiniz. </li><li> 1X PBS ile örnek durulayın. Pipet 100-200 numune içine 1X PBS mcL ve yedekleme emmek. PBS atın. Toz ve enkaz kaldırmak için gerekli tekrarlayın. </li></ol> 6. Bir slayt Mount numune (ler) <ol><li> Pipet 80-90 mcL dikdörtgen şeklinde yeni bir slayt üzerine% 90 gliserol. Gliserol, hatta bir dikdörtgen karalama yapmak için pipet ucu tarafında kullanın. (Bu bir slayt iki RPE montaj için bir işlemdir.) </li><li> , Örnek altında 15 ° forseps alt kolu takın. Diseksiyon slayt kapalı örnek yavaşça kaldırın. </li><li> Gliserol içine yavaşça örnek daha düşüktür. Yavaşça numune altından onları çekin forseps wiggle. </li><li> Diğer örnek için 6,1-6,3 adımları tekrarlayın. </li><li> Uzun kenarı vücudunuzun dik böylece slayt döndürün. Kapak cam tutun 45 ° slayt dokunmadan böylece slayt açı. Dokunmak kadar gliserol smear doğru hareket ettirin. Kapak cam ve slayt arasındaki temas sağlanması, slayt kenarına doğru yavaş yavaş, smear uzak kapak cam taşımak. Slayt, uzun kenarlarında ve kapak cam hizaya böylece paralel. Başparmak ve işaret parmağı arasındaki kapak cam köşelerinden tutun. </li><li> Diğer taraftan 15 ° forseps Pick up. Üst (ücretsiz) kol Crook kapak cam kenarına Cradle. Çok yavaş, kapağı cam düşüktür. Kapak cam ve gliserol arasındaki temas yapıldığında, durdurma ve gliserol geçirmek için bekleyin. Bu düşürücü ve RPE bütün bağlar tamamen kaplıdır kadar bekleyen tekrarlayın. Bu hava kabarcıkları yakalamak oldukça viskoz gliserol önlemek için. COVERGLASS aşağı doğru itin VERMEYİN - gliserol yapışma çok zayıf altında sıkmak. </li><li> Açık oje, kapak cam ve slayt karşılamak çevresinde boya. </li><li> Kuruması için boş bir raf üstünde slayt yerleştirin. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: Bu prosedürün sonucu, bir çiçek gibi görünüyor ve oldukça simetrik olmalıdır bir yapı olmalıdır. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Tüm montaj RPE wild tip C67Bl/6J fare, siyah veya agouti hayvanların gelen RPE koyu kahverengi renkli olmalı ve pürüzsüz bir yüzeye sahip olmalıdır . Bu yaprakları topografya dalgalı fark normaldir. Verecek herhangi bir numune üzerinde pigmentasyon RPE ve altta yatan koroid hem değişken pigmentasyon yoğunluğu nedeniyle biraz değişken olabilir. Beyaz oklar hipopigmente "kanallar" noktası - Bu normal bir durumdur ve göz altında yatan damarsal nedeniyle. RPE ve altta yatan koroid hem fiziksel hasar Mavi ok puan. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Seyreltilmiş fare Tüm montaj RPE. Seyreltik hayvanlardan elde edilen hasat Örnekler café au lait neredeyse saydam renk değişebilir ve herhangi bir örnek siyah daireler burada belirtilen, içinde değişkenlik olması gibi. Genel olarak, genç hayvanlardan elde edilen hasat RPE, daha hafif ve yaşlı hayvanlarda hasat koyu. Siyah oklar hipopigmente görünen altta yatan damarsal bazı göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Phalloidin boyama RPE fiziksel hasar tespit etmek için kullanılabilir. Phalloidin boyama hücre açıkça özetliyorepitelin altıgen şekil gösteren membranlar. (A) siyah bir fare örneği. (B) seyreltilmiş fare örneği. <img src="/files/ftp_upload/2563/2563fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Seyreltilmiş fare kötü disseke RPE (A) Parantezler ve / veya katlama burkulma neden olabilir korneanın çok geniş marjları gösterir. Siyah bir daire içinde gözün arka kaldırıldı gereksiz doku aşırı miktarda görebilirsiniz. Örnek seyreltik bir hayvan çünkü özellikle açıktır. Sol alt taç yaprağı kısmen katlanmış. (B) Tüm bu montaj bir fırıldak bir görünüme sahiptir. Siyah oklar yapılmış olan bazı kesim göstermektedir. Birçok optik sinir başı doğru corneo-skleral bölmek kesim çapı ile uyumlu değildir. (C) Siyah oklar keser teğet çapı ve dik doğrultusunda yapılmış olmalıdır nasıl göstermektedir.

<ol><li>Bishop, A. J., Kosaras, B., Sidman, R. L., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Benzo%28a%29pyrene+andX-rays+induce+reversions+of+the+pink-eyed+unstable+mutation+in+the+retinal+pigmentepithelium+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res.%22%5BJournal%5D)">Benzo(a)pyrene andX-rays induce reversions of the pink-eyed unstable mutation in the retinal pigmentepithelium of mice.</a> Mutat. Res.. 457, 31-31 (2000).</li>
<li>Reliene, R. H. lavacove, Mahadevan, A., Baird, B., M, W., Schiestl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diesel+exhaust+particles+cause+increased+levels+of+DNA+deletions+after+transplacental+exposure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Diesel exhaust particles cause increased levels of DNA deletions after transplacental exposure in mice.</a> Mutat. Res. 570, 245-2452 (2005).</li>
<li>Bishop, A. J., Barlow, C., Wynshaw-Boris, A. J., Scheistl, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atm+deficiency+causes+increased+frequency+of+intrachromosomal+homologous+recombination+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Atm deficiency causes increased frequency of intrachromosomal homologous recombination in mice.</a> Cancer Res. 60, 395-399 (2000).</li>
<li>Brown, A. D., Claybon, A. B., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+WRN+helicase+domain+is+not+required+for+spontaneous+homologous+recombination-mediated+DNA+deletion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nucleic+Acids%22%5BJournal%5D)">Mouse WRN helicase domain is not required for spontaneous homologous recombination-mediated DNA deletion.</a> J. Nucleic Acids. , (2010).</li>
<li>Claybon, A., Karia, B., Bruce, C., Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PARP1+suppresses+homologous+recombination+events+in+mice+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">PARP1 suppresses homologous recombination events in mice in vivo.</a> Nucleic Acids Res. , Forthcoming (2010).</li>
<li>Bishop, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p53-%2C+and+Gadd45a-deficient+mice+show+an+increased+frequency+ofhomologous+recombination+at+different+stages+during+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">p53-, and Gadd45a-deficient mice show an increased frequency ofhomologous recombination at different stages during development.</a> Cancer Res. 63, 5335-5343 (2003).</li>
<li>Bodenstein, L., Sidman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+and+development+of+the+mouse+retinalpigment+epithelium.+Part+I.+Cell+and+tissue+morphometrics+and+topography+of+mitoticactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth and development of the mouse retinalpigment epithelium. Part I. Cell and tissue morphometrics and topography of mitoticactivity.</a> Dev Biol. 121, 192-204 (1987).</li>
<li>Burke, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epithelial+phenotype+and+the+RPE%3A+is+the+answer+blowing+in+the+Wnt%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin.+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Epithelial phenotype and the RPE: is the answer blowing in the Wnt?</a> Prog Retin. Eye Res. 27, 579-595 (2008).</li>
</ol>

RPE bir homoloji yönettiği onarım in vivo tayininde, p un testin sitesidir. P un tahlil homoloji yönettiği onarım sıklığı üzerine etkileri farklı DNA zararların 1,2 ve DNA hasarı sinyalizasyon ve onarım genleri 3,4,5 incelemek için kullanılır olmuştur. Bu testte, RPE 1 tek hücreli olaylar tespit son derece duyarlıdır. Ayrıca homoloji yönettiği onarım olayların gelişimi 6 sırasında zamanlama farklılıkları tespit edebilirsiniz. Fare gözün ...

<table><tbody><tr><td>düz pens</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-4903</td><td>uç: .08 x .04 mm malzeme: INOX</td></tr><tr><td>45&amp;#x00B0; pens</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5005</td><td>uç: .05 x.01 mm malzeme: INOX</td></tr><tr><td>15&amp;#x00B0; &quot;yukarı&quot; pens</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5045A</td><td>uç: .1 x.06 mm malzeme: INOX</td></tr><tr><td>yaylı makas</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-5604</td><td>komb. uç genişliği 0.3mm kesici kenar uzunluğu 3mm malzeme: paslanmaz çelik</td></tr><tr><td>binoküler diseksiyon mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td>Discovery V.8</td><td>yansıtmalı ışık kaynağı kullanın</td></tr><tr><td>falolidin</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546</td></tr></tbody></table>

retina pigment epiteli tüm mount fare göz diseksiyon

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

Memeli gözün arkasındaki retina pigment epitel (RPE), fotoreseptör (çubuklar ve koniler) içeren nöral retina altında yatıyor. RPE yakından sadece yukarıda nöral retina ile pigmentli küboid hücreleri ve iştiraklerin tek tabaka. Bu dernek, retina hastalıklarının çalışan araştırmacılar büyük ilgi RPE yapar. RPE homoloji yönettiği DNA onarımı, p un tahlil in vivo tayininde bir sitedir. Küçük boyutu nedeniyle teşrih (çapı 3.5mm hakkında) ve küresel şekli fare göz özellikle zordur. Bu makalede ayrıntılı olarak RPE bir bütün montaj ile sonuçlanan göz diseksiyon için bir prosedür ortaya koymaktadır. Bu prosedürde, küresel yapısı, karşı göz ile değil, nasıl çalıştığını gösteriyor. Kısaca, bağ dokusu, kas, ve optik sinir gözün arka kaldırılır. Sonra, kornea ve lens kaldırılır. Sonraki kalan doku önemli düzleşme, stratejik kesimler bu sonucu yapılır. Son olarak, nöral retina nazikçe, hala altta yatan koroid ve sklera bağlı bozulmamış bir RPE, ifşa, kapalı olduğunu kaldırdı. Bütün bu montaj p un tahlil veya RPE doku immünhistokimya veya immunofluorescent değerlendirilmesi için gerçekleştirmek için kullanılabilir.

Bir fare göz diseksiyon resmi bir gösteri, retinal pigment epitel bir bütün montaj.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Retinal pigment epitelyumu (RPE), memeli gözünün arka kısmında, fotoreseptörleri (çomaklar ve... içeren nöral retinanın hemen altında yer alır.

Benim adım Allison Clavon. Teksas, San Antonio'daki UT Health Science Center bünyesindeki Gree Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü'nde Dr. Alex Bishop'un araştırma asistanıyım. Bugün, retinal pigment epitelyumun tamamını elde etmek için bir kemirgen gözünün nasıl diseke edileceğini göstereceğim.Bu doku, retinal gelişim ve hastalıkların incelenmesi açısından önem taşımakta olup aynı zamanda in vivo homoloji yönlendirmeli DNA onarım analizinin gerçekleştirildiği bölgedir. Öyleyse başlayalım. Burada diseksiyona hazır bir göz bulunmaktadır.Öncelikle, prosedür boyunca referans noktası olarak kullanacağınız anatomik yapılara bir göz atalım. Bu, seyreltilmiş bir hayvandan alınan gözdür. İşte gözün arkasında, karşı tarafta yer alan optik sinir.Bu korneadır. İris, korneanın arkasından görünür. Gözün arkasındaki beyaz bölge ise skleradır.Bu nedenle, bu bölge kornea skleral sınır olarak adlandırılır. Diseksiyonun ilk adımı, kas bağ dokusu ve optik sinir gibi yabancı dokuların uzaklaştırılmasıdır. Ardından, dairesel bir kesi yapılarak kornea çıkarılmalıdır.Bu aşamada lens çıkarılarak içi boş bir göz çanağı elde edilebilir. Ardından, kornea-sklera sınırından optik sinir başına doğru dört kesi yapılır. Ortaya çıkan yapı dört taç yapraklı bir çiçeğe benzer.Bu dört taç yaprağın her biri daha sonra ortadan kesilerek sekiz yapraklı bir çiçeğe benzeyen bir yapı elde edilir. Bu aşamada, küresel yapısı nedeniyle belirli bölgelerde bükülmeler meydana gelebilir. Bunu önlemek ve daha düz bir delik montajı sağlamak için bükülmenin olduğu noktaları hafifçe geçen sekiz kısa kesik atabilirsiniz.Çalışma alanınızda 100 veya 200 µL pipet ve uygun uçları, bir adet 35 mm X-P-B-S-A kap, lam ve lameller, lam hazırlığı için %90 gliserol ve şeffaf oje, lamları kurutmak için bir raf, bir kutu Kim wipes ve bir atık konteyneri dahil olmak üzere çeşitli malzemelerin elinizin altında olması gerekir. Bu yaygın malzemelere ek olarak; diseksiyon boyunca gözü tutmak, çevirmek ve genel olarak manipüle etmek için kullanılan düz pensetler ve 45 derece açılı pensetler dahil olmak üzere bir set özel mikrodisseksiyon aracına da ihtiyacınız olacaktır. 15 derecelik bu pensetler yukarı doğru bir açıya sahiptir ve gözün tutulması ve manipülasyonu için kullanılırlar.Son olarak, bir çift yaylı makasa ihtiyacınız olacak. Geleneksel tarzda makaslar yerine yaylı makas kullanmanız çok önemlidir. Bu diseksiyon için, diseksiyona başlamadan önce, dik oturduğunuzda gözlerinizin okülerlerle aynı seviyede olacağı şekilde sandalye yüksekliğinizin ayarlandığından emin olun.Mikroskop başında kambur durmak omuz ve sırt ağrılarına yol açar ve diseksiyonlarınızın kalitesini düşürür. Başlamak için 35 milimetrelik kabın kapağına bir miktar XPBS dökün. Ardından, diseksiyon yapmayı planladığınız gözleri kabın içine aktarın.Bu, yaban tipi bir C 57 siyah faresinden alınan bir gözdür. Çapı yaklaşık üç buçuk milimetre ile oldukça küçük olduğunu görebilirsiniz. Sklera opasitesi, göze mavimsi bir renk verir.Diseksiyonun ilk adımı, kas bağ dokusu ve optik sinir gibi gözün etrafındaki tüm yabancı dokuların temizlenmesidir. Burada sol elimde 45 derecelik pens, sağ elimde ise 15 derecelik pens bulunmaktadır. Dokuları çekerken gözü sabitlemek için bir çift pens kullanabilirsiniz.Büyük bir doku parçası ayrıldığında, pensetinizi bir Kim wipe ile dikkatlice silin. Gözü ezmemeye veya delmemeye özen gösterin. Bu diseksiyonun süspansiyon içinde gerçekleştirilmesinin faydalarından biri, gözden ayrılıp yüzen bağ dokusunu kolayca görebilmenizdir.Sonunda, pensle daha fazla doku çıkaramadığınız bir noktaya geleceksiniz. 15 derecelik açılı pensinizi yaylı makasla değiştirin. Optik siniri kesmek için yaylı makası kullanın.Dokuyu kornea sklera sınırına doğru ileri itmek için bıçağın dış kenarını kullanın. Ardından makasınızı düzeltin ve bir kim wipe ile nazikçe silin. Buna tekrar bakalım.Doku yukarı doğru kalktığında, makasınızın dış kenarı ile dokuyu kornea sklera sınırına doğru ileriye itin. Kırpın; doku parçalarını makasınızın küt kenarıyla ileriye itmeye ve tüm yabancı dokular temizlenene kadar bunları kırpıp uzaklaştırmaya devam edin. Göz üzerinde genellikle iki şerit sert doku bulunur.Birincisi kornea sklera sınırına tutturulmuştur ve ikincisinin kırpıldığı görülmektedir. Burası, kornea sklera sınırı ile optik sinir başının yaklaşık olarak orta noktasıdır. Diseksiyonun bir sonraki adımı kornea ve lensin çıkarılmasıdır.Korneanın yaklaşık orta kısmında bir flebi kaldırmak için 45 derecelik pensinizi kullanın. Ardından, flebin tabanında küçük bir insizyon yapmak için yaylı makasınızı kullanın. Makasınızın alt bıçağını, iris altına doğru insizyondan içeri yerleştirin.Kornea skleral birleşimine doğru, ancak içine girmeden bir kesi yapın. Şimdi, gözü yavaşça 360 derece döndürerek çevresine küçük kesiler yapın. Makası irisin altında tutmaya çalışarak hem korneayı hem de irisi aynı anda kesin.Burada gösterdiğim kadar kolayca yapabilmek için çok fazla pratik yapmak gerekir. Kornea çıkarıldıktan sonra, gözü yan çevirin ve lensi dışarı iterek gözün dış kısmına hafifçe bastırın. Geriye kalan yapı bir çanağa benzeyecektir.Göz dörde bölünmelidir. Bunun için gözü yan çevirin ve yaylı makasınızın alt bıçağını yerleştirin. Optik sinir başına doğru, ancak tam üzerine ulaşmayacak şekilde boylamsal bir kesi yapın.Bunu yapmak için kollarınızı yanlarda tutun ve makasınızı vücudunuza ve göz kesiğine yaklaşık olarak dik olacak şekilde önünüzde konumlandırın. İkinci kesiğinizi doğrudan birinci kesiğin karşısına yapın. Pürüzsüz bir kesim yapabilmek için hizalama aşamasında acele etmeyin.Birden fazla kesim yapmak tırtıklı kenarlara neden olabilir, ancak dikkatlice hizalandıklarında bunlar fark edilmez; göz normal şeklini koruduğu için gözün bu küresel yapısına karşı gelmek yerine onunla nasıl uyumlu çalışabildiğime dikkat edin. PBS içinde bekletildikten sonra, diseksiyonun geri kalanı bir lam üzerinde gerçekleştirilecektir. Gözü 45 derecelik açılı pensinizle kavrayın ve PBS'den dışarı çıkarın.Gözü temiz bir lam üzerine yerleştirin. Her iki adet açılı pensi kullanarak gözü dikkatlice açın. Gözün çevresinde, tutmayı kolaylaştıran küçük bir kornea ve iris kenarı olduğu dikkat çekecektir.Ardından, dört petalden her birini ortadan ikiye kesmeniz gerekir. Gözü, petallerden biri vücudunuza dik gelecek şekilde döndürün. Petalin köşesini 15 derecelik açılı pensetinizle kavrayın.Hafifçe yukarı kaldırın ve ardından kornea skleral sınırından optik sinir başına doğru bir kesi yapın. Bu kesiler bir teğete dik olmalıdır. Teğet, çapa dik olan bir çizgidir.Bu nedenle, yaptığınız kesikler gözün çapıyla aynı hizada olmalıdır. Şimdi, bir sonraki pedal vücudunuza dik olacak şekilde lamı döndürün ve işlemi tekrarlayın. Pedalın köşesini kavrayın.Hafifçe kaldırın ve kesin. Dört büyük pedalın her biri ikiye bölünene kadar işlemi tekrarlayın. Beyazımsı madde, RPE'nin hemen üzerinde yer alan nöral retinadır.Nöral retina, RPE'yi koruyabilir, bu nedenle tüm kesimleriniz tamamlanana kadar ona dokunmayın. Pedalların hafifçe kavisli olduğunu fark edin. Buna karşı zorlamayın.Tek seferde düzgün bir kesim yapabilmek için hizalama işlemini acele etmeden gerçekleştirin. Göz yuvarlak olduğu için bükülme eğilimi gösterir; bu bükülmeyi önlemek için sekiz adet kısa kesik atabilirsiniz.Her bir pedal üzerine bir adet. Önceki dört kesim turundaki temel stratejiyi uygulayın. Pedalın köşesini kaldırıp kesin, ancak bu durumda pedal uzunluğunun yalnızca yaklaşık yarısına kadar kesin.Tüm kesimler tamamlandıktan sonra nöral retinayı çıkarabilirsiniz. Burada numuneye birkaç damla 1X PBS ekliyorum. RPE'nin kurumasını istemezsiniz.Nöral retina, altındaki RPE ile sadece gevşek bir şekilde ilişkili olmalıdır. Oldukça kolayca ayrıldığını görebilirsiniz. Ancak, gözün iç kısmında siliyer cisim adı verilen tümsek bir sırt olan kornea-sklera ayrımında genellikle yapışık kalacaktır.Nöral retinayı soyarken örneği sabitlemek için 15 derecelik pensetin ucunu optik sinir başına yerleştirebilirsiniz. Siliyer cisim, yerinden ayrılan koyu pigmentli doku olan RPE'nin kenarını belirler. Buradaki irisdir, RPE değildir.İrisin mümkün olduğunca fazla kısmının çıkarılmasını öneririm; çünkü iris çok yapışkandır ve nöral retina pul pul dökülmüşse veya kalıntıları RPE'ye yapışık kalmışsa, katlanıp RPE'ye yapışabilir. Muhtemelen iki durumdan biri yanlış gitmiştir. Ya gözler, çok uzun veya çok kısa süre gibi uygun olmayan bir süreyle fiksasyon işlemine tabi tutulmuştur ya da diseksiyondan önce çok uzun süre depolanmışlardır.Burada açığa çıkardığım pedal henüz kısayoluna sahip değildir. Pedalin, RPE kenarından yaklaşık üçte bir mesafe uzaklıkta olduğunu görebilirsiniz. Sekiz kısayolun önerilmesinin nedeni budur.Nöral retinanın tamamı uzaklaştırıldıktan sonra, tüm toz ve kalıntılar temizlenene kadar bir pipet yardımıyla RPE'yi birkaç kez 100 ila 200 µL PBS ile durulayın. Temiz bir lam üzerine dikdörtgen şeklinde 80 ila 90 µL %90 gliserol ekleyin. Not: Bu hacim, 22 x 50 mm'lik bir lamel için optimal gliserol miktarıdır ve buna göre ayarlanmalıdır.Diğer boyutlardaki lameller için gliserolü yaymak amacıyla pipet ucunuzu kullanın. Gliserole hava kabarcığı eklememeye dikkat edin. Eğer bir kabarcık oluşursa, onu patlayacağı kenara doğru sürükleyin.15 derecelik pensetinizin alt kolunu RPE'nin altına kaydırın ve dikkatlice kaldırın, ardından RPE'yi yavaşça gliserolün içine indirin. RPE gliserolün üzerinde yüzecek ve hafifçe kıvrılabilir veya bükülebilir. RPE'yi düzeltmek ve gliserolü RPE'nin yüzeyine yaymak için pensetinizi kullanın.Herhangi bir hava kabarcığı oluşursa, lamel camını yaklaşık 45 derece açıyla tutarak bu kabarcıkları, patlayacakları kenara doğru sürükleyin. Ardından lameli gliserolün kenarına değdirin.Ardından lamın kenarına doğru hareket ettirin. Lamelin alt kısmını başparmağınız ve işaret parmağınızla tutun ve karşı kenarı 15 derecelik pensinizle destekleyin. Temas gerçekleşir gerçekleşmez lameli çok yavaş bir şekilde lama doğru indirin.RPE ile birlikte indirmeyi durdurun, gliserolün yayılmasına izin verin ve ardından lamel camını yavaşça indirmeye devam edin. Lamel camını çok hızlı indirirseniz, lamelinize hava kabarcıkları girecektir. Gliserolün yayılmasını sağlamak için lamel camı RPE'ye temas ederken onu yavaşça indireceğim.Lamı hızlıca bıraktığımda hava kabarcıklarının oluştuğunu görebilirsiniz. Lamel kenarını sabitlemek için bol miktarda şeffaf oje kullanın. Camı lama tüm çevre boyunca tamamen yapıştırın.Bu, C 57 siyah faresinden alınan tipik bir RPE'dir. Burada belirtildiği gibi, alttaki damarlanmanın görülmesi normaldir. Ayrıca, daha az pigmente görünmüş yamalar gibi pigmentasyonda bazı farklılıkların görülmesi de normaldir.Bununla birlikte, bu tür şeffaf lekelerin RPE ve altındaki koroidde meydana gelen fiziksel hasarlardan kaynaklanması muhtemeldir. Gözün koroid tabakası da pigmentli olduğundan, koroid sağlam kaldığı sürece siyah bir RPE'deki hasarın fark edilmemesi mümkündür.Bu, dilüte bir fareden alınan tipik bir RPE'dir. Belirtildiği üzere, vaskülatürü görebilirsiniz ve daha koyu yamalar ile daha açık yamalar gibi pigmentasyonda bazı farklılıklar olacaktır. Ancak, dilüte bir RPE üzerinde hasarı görmek neredeyse imkansızdır.Bu küçük yamalar hasar mı yoksa pigmentasyondaki normal varyasyonlar mı? Bu soruyu yanıtlamak için foid ve boyama yapılmasını öneririm. Bu, örneklere çok sert davranıp davranmadığınız konusunda size bir fikir verecektir.Boyama, hücre membranlarını net bir şekilde belirginleştirerek hasarlı bölgeleri görünür kılar; ancak gerçekte RPE oldukça dayanıklıdır ve göze kornea kısmından tutarsanız hasar verme olasılığınız düşüktür. Burada, birçok sorun içeren bir bütün mont örneği görülmektedir; burada belirtilen en küçük sorun, kornea kenarının çok geniş bırakılmış olmasıdır ve bu durum kıvrımlı materyalin büzülmesine ve katlanmasına yol açabilir. Burada, gözün arka kısmında kalan çok büyük miktarda yabancı doku olduğunu görebilirsiniz.Bu pedal kısmen katlanmış durumdadır ve burada RPE'nin kısmen yırtıldığını görebilirsiniz. Bir diğer sorun ise bu gözün rüzgar gülü görünümünde olmasıdır. Burada kesiklerin açılarını çizdim.Ancak, olması gereken halこれが buydu. Unutmayın, kesimleriniz teğete dik ve çapla aynı hizada olmalıdır. Fare gözünün, retinal pigmentin bütün mount hazırlığı için nasıl diseke edileceğini göstermiş oldum.Epitel doku çalışırken en önemli nokta doğru duruşu korumaktır, ancak gevşek kalmaya çalışın. Bu videoyu faydalı bulduğunuzu umuyor ve gelecekteki deneylerinizde size başarılar diliyorum.

dissection-mouse-eye-for-whole-mount-retinal-pigment

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Diseksiyon tekniği vitreus, retina ve lens gelen fare göz, santrifüj yoluyla ayrılması ve protein deneyleri ile karakterizasyonu eviserasyon göstermektedir.

Proteomik Analizleri Fare Vitreus ve Retina eviserasyon

Diseksiyon tekniği high-throughput ekranlarında fenotipleme gerçekleştirmek için doku fiksasyonu fare gözün enükleasyonu göstermektedir.

Uzaktan Yüksek throughput fenotipleme için Fare Göz Enükleasyon

Burada açıklanan protokol, tam montajlı bir retinal preparatın yapısal değerlendirmesi içindir. Bu, doku diseksiyonunun tanımlarını, hidrofilize politetrafloroetilen (PTFE) membran ekine montajı, floresan işaretleyicilerle bolus yüklemesini ve hücresel ve sinaptik bileşenlerin immünohistokimyasal analizi için karbodiimid ve paraformaldehit ile fiksasyonun karşılaştırılmasını içerir.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Bu raporda, immünhistokimya (ıHC) için dondurulmuş fare Retina bölümlerini hazırlamak için kapsamlı yöntemler açıklanmaktadır.  Tanımlanan yöntemlerle oküler posterior bardak diseksiyonu, paraformaldehit fikstasyon, optimum kesme sıcaklığı (OCT) medya ve doku oryantasyonu, seksiyonlama ve immünostasyonu katıştırma bulunmaktadır.

Immünhistokimya için fare retinal Cryo-bölümler hazırlanması

İlk olarak 20161'deFernandez-Godino ve arkadaşları tarafından bildirilen bu protokol, Transwell plakalarında bir hafta içinde işlevsel ve polarize bir RPE monolayer oluşturan fare RPE hücrelerini verimli bir şekilde izole etmek ve kültüre etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. İşlem yaklaşık 3 saat sürer.

Birincil Fare Retina Pigment Epitel Hücrelerinin Verimli Diseksiyonu ve Kültürü

Bu yazıda kemirgenlerde oküler mikrodiseksiyon için bir protokol sunulmaktadır. İşlem, göz küresinin niktitasyon zarı (yani üçüncü göz kapağı) ile birlikte enükleasyonunu içerir. Bunu daha sonra arka ve ön göz kapaklarının ayrılması izler.

Kemirgen Gözün Mikrodiseksiyonu

Fare modelleri, retinal pigmentli epitelin (RPE) biyolojisini araştırmak için yararlı araçlar olabilir. Farelerin bir dizi RPE patolojisi geliştirebileceği tespit edilmiştir. Burada, ışık, iletim elektronu ve konfokal mikroskopi kullanarak farelerde RPE patolojilerini aydınlatmak ve ölçmek için bir fenotipleme protokolü tarif ediyoruz.

Yaşa Bağlı Makula Dejenerasyonunun Fare Modellerinde Retinal Pigmentli Epitel Patolojilerini Değerlendirme ve Ölçme Protokolü

Retina pigment epiteli (RPE), koroid ve retina arasında çok önemli bir bariyer görevi görür ve fotoreseptörler gibi retina hücre tiplerinin sağlığını ve işlevini destekler. Burada, yetişkin murin RPE'yi izole etmek ve kültürlemek için basit ve etkili bir protokol açıklıyoruz.

Yetişkin Farelerden Retinal Pigment Epitel Hücrelerinin İzolasyonu ve Kültürü için Basitleştirilmiş Bir Yöntem

Bu protokol, tüm retina montajlı fare retinasını izole etme ve tüm retinal ganglion hücrelerini (RGC'ler) etiketlemek için immün boyama gerçekleştirme prosedürünü açıklar. İşlemi, yapay zeka tabanlı yazılım kullanılarak RGC'lerin görüntülenmesi ve otomatik olarak sayılması takip eder ve bu da tüm fare retinasındaki RGC'leri ölçmek için basit, hızlı ve doğru bir yöntem sağlar.

Tam montajlı immün boyama ve fare retinal ganglion hücrelerinin otomatik sayımı

Fare retinal kriyoseksiyonlarının hazırlanması ve fotoreseptörler üzerinde immün boyama yapılması için bir protokol tanımlanmıştır. Bu makale, araştırmacıların iyi korunmuş morfoloji ve yüksek kaliteli immün boyama sonuçları ile fare retinal donmuş kesitlerini tutarlı bir şekilde üretmelerini sağlar.

Fare Retinasının Kriyoseksiyonu ve İmmün Boyanması

Retina, laminer yapısı boyunca karmaşık uzamsal organizasyon sergiler. Modern mekansal transkriptomik ve dizileme teknikleri, 20 μm kalınlığında doku kesitleri &lt; gerektirir ve bu da retinal araştırma uygulanabilirliklerini sınırlar. Bu taze dondurulmuş kriyoseksiyon yöntemi, düzlemsel uzamsal ilişkileri korurken fare retinasının ince yüz kesitlerini üretir ve laminalar arasında kapsamlı moleküler haritalama sağlar.

En yüz Yüksek Boyutlu Mekansal Moleküler Analiz için Fare Retinasının Kriyoseksiyonu

Öğrenin fare gözü diseksiyonu ile retinal pigment epiteli tüm mount preparasyonu tekniğini. Bu yöntem retinal gelişim ve hastalıklar üzerine nörobilim araştırmalarında temel oluşturur.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

Daha fazla video keşfet