Name: Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-17T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 57 s
Description: Öğrenin, organotipik serebellar kültürlerde apoptotik zorlukların etkilerini farelerde incelemeyi. Bu yöntem, serebellar hücre canlılığını ve gelişimsel farklılıkları analiz etmek için kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada IPSEN Vakfı tarafından finanse edildi. IMV, Moleküler Biyoloji Amerikan Kanser Derneği Profesörü ve Örnek Yaşam Bilimleri Irwin ve Joan Jacobs Başkanı tutar. Bu çalışma NIH, Leducq Vakfı, Meriaux Vakfı, Ellison Tıp Vakfı, Ipsen / Biomeasure, Sanofi Aventis, Prostat Kanseri Vakfı, HN ve Frances C. Berger Vakfı hibe kısmen desteklenmiştir. PAS Nörobilim ve Uyuşturucu (R01 DA019022) Ulusal Enstitüsü McKnight Endowment Fund tarafından finanse edilmektedir. Yazarlar Mark Schmitt teşekkür etmek istiyorum. Grafik sanat, Murat T. Simon tarafından dizayn edilmiştir. Sponsorluk nazik Invitrogen tarafından sağlanmıştır.

1. Organotipik Serebellar Kültürler: <ol><li> Organotipik serebellar kültürler başarıyla oluşturmak için P0-P3 veya P8-P12 arasındaki fareler kullanın. Deneme için bu gelişimsel aşamada, bizim çalışmamız için daha uygun olması nedeniyle, P8-P12 serisi fareler kullanıldı. </li><li> Diseksiyon ve kültür ortamı hazırlayın: <ol><li> Beyin diseksiyonu ve dilim hazırlama 1mm kalsiyum klorür içeren düşük sodyumlu Yapay Beyin Omurilik Sıvısı (ACSF), 10mM D-Glukoz, 4mm potasyum klorür, 5mM magnezyum klorür, 26mm sodyum bikarbonat, 246mM sakaroz ve fenol kırmızısı çözeltisi (1:1000) yürütülmektedir pH 7.3. Çözüm sterilize etmek için, 4 .22 mikron filtre ve mağaza üzerinden filtre ° C </li><li> Serebellar dilimleri% 75 Minimum Essential Orta Kartalı (MEM),% 25 ısı ile inaktive edilmiş at serumu, 25mm Hepes, 1mm glutamin, 5 mg / ml glikoz, penisilin (100 U / ml) ve streptomisin (100 U / ml) kültür. Iki hafta en fazla 4 0.22 mikron filtre ve mağaza ° C ile orta Filtresi. </li></ol></li><li> Kırmızıdan turuncuya kayacak önceden Carbogen (% 95 oksijen ve% 5 karbon dioksit) Not kabarmış buz ACSF orta beyin teşrih, Carbogen doyma çözeltinin pH değişecek. Diseksiyonu beyin yapısına zarar vermemek için dikkatli olmak mümkün zaman minimum tutar yapılmalıdır. </li><li> Vibratome kullanarak 400 mikron sagital bölümlerde beyin dilimleyin. <ol><li> Beyincik mümkün olduğunca az kesmeye çalışırken bir yarımkürede bir jilet ile sagital kesme olun; bu dilimleme için düz bir yüzey sağlayacaktır. Korteks destek için dilimleme kolaylaştırmak için kullanılır ama zaman önemli bir konudur çünkü bir jiletle kesip korteksin rostral yarısında daha uygun. </li><li> (Superglue), metal vibratome plaka üzerinde beyin konumunu düzeltmek için siyanoakrilat kullanın. Tutkal eklemeden önce buz üzerinde plaka soğuk ve ince bir yapışkan tabaka oluşturacak şekilde tüp ucunu kullanarak iyi yaymak için çok önemlidir. Superglue fazlalığı varsa ACSF ve örnek kaybolur temas geldiğinde, plaka terketmez. </li><li> Sonra beyin, beyin kapak ve levha, soğuk tutmak için aşağıda buz koymak için yeterli ACSF medya eklemek vibratome plaka takılı. </li><li> 400 mikron dilim kesin ve bir plastik Pasteur pipeti (genişletmek ve dilimleri zarar görmesini önlemek için ucu kesilmiş) 6-iyi hücre kültürü plaka buz üzerinde ACSF içeren bir transfer. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında iki insülin şırıngaları (28 gauge iğne ile küçük çaplı şırınga) yardımıyla beynin geri kalanı beyincik ayırın. Bazı dilim superglue kenarlarına bağlı olacaktır: Bu dilim canlılığı etkileyebilir olarak kaldırmak için denemek için bir an. Serebellar yapıya zarar vermeden dikkatli bir şekilde bunu yapmak için çok önemlidir. </li></ol></li><li> 0.4 mikron gözenekleri ile 30mm kültür plaka ekler içeren 6-kuyucuğu serebellar dilim aktarın. 1 ml kültür ortamı başına iyi, 37 en az 2 saat süreyle inkübasyon tarafından önceden klimalı ° C ve% 5 CO 2 (hücre kültürü inkübatörde). Ekler altında hapsolmuş hava kabarcıkları ve daha sonra tamamen genişletilmiş emin olun ekler ve sıvı onları kapsayan üst serebellar dilimleri yerleştirin (insert ortalama 1-3) emin olun medyanın üstüne yerleştirin. Gerekirse medya aşan aspire edin. 37 inkübe ° C ve% 5 CO 2 kültür ortamı her 2 ya da 3 gün değişiyor. Kullanılan orta dilim kaynaklı hücre sağkalım için önemli olan trofik faktörler içerir, çünkü bir seferde orta (örneğin ½ hacmi) yalnızca bir bölümünü değiştirmek için en iyisidir. </li></ol> 2. Sülfüroz Tedavi ve Serebellar Dilimleri boyanması: <ol><li> Apoptotik meydan deneme için, öncelikle kültür, in vitro 3 (DIV3) günü medya değişen 5 gün dilimleri . DIV5 kültürleri hücre ölümü temiz bir arka plan ortam değişiklikleri beri sahip olmak için doğrudan medyaya ekleyerek Fas agonist antikoru Jo2 0.5 mikrogram / ml ile tedavi edilir kültürlerde bazı ölüm neden olabilir. Kuyuların yarısı kontrol grubu olarak tedavi edilmezse. </li><li> 24 saat emme ekler altındaki medya kaldırdıktan sonra. Dilimleri düzeltmek için, altındaki buz gibi% 4 PFA 1 ml ve 1 ml eklemek yukarıda ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. </li><li> 10 dakika PFA kaldırın ve kısa bir süre soğuk PBS ile yıkama sonra. </li><li> Sonraki PBS çıkartın ve oda sıcaklığında 5 dakika inkübe PBS ve% 20 buz metanol eklemek üzerinde 1 ml altında ve 1 ml ekleyin. </li><li> PBS ile tekrar yıkayın ve altına 1 ml ve üzerinde 1 ml Triton X-100 PBS içinde% 0,5 permeabilization ekleme ekleyin. 4 en az 12 saat inkübe ° C. </li><li> Permeabilization sonra, en az PBS içinde% 20 BSA ile bloke4 saat oda sıcaklığında ya da geceleme 4 ° C Bu aşamada, dilim, en az 3 gün, 4 ° C engelleme çözüm tutulabilir </li><li> Dilimleri dikkatle serebellar dilim bağlı eklemek membran parça kesme ve PBS içeren 24 kuyucuğu transfer leke için. </li><li> Immün TUNEL reaktif ile ilk bir saat ve Calbidin antikor ile bir gecede, sırayla yapılır. <ol><li> PBS aspire edin ve her dilim tüm yüzeyini kaplayan emin TUNEL reaktif 250 mcL ekleyin. Karanlık bir saat için 37 ° C'de inkübe edin. </li><li> TUNEL karışımı kaldırmak ve bir saat 10 dakika PBS ile üç defa yıkamak sonra. </li><li> Son yıkamadan sonra, PBS kaldırmak ve 1 / 1000 PBS içinde Calbindin antikor seyreltme 250 mcL ekleyin ve 4 gece boyunca inkübe ° C de karanlıkta. </li><li> Birincil antikor çözüm çıkarın ve 10 dakika PBS ile üç kez yıkayın. </li><li> Ikincil antikor ekle 250 mcL karanlıkta oda sıcaklığında en az üç saat süreyle inkübe PBS ve 1 / 500 sulandırılmış. TUNEL kiti kullanılan TMR kırmızı etiketli bu nedenle Calbindin için sekonder antikoru Alexa-488 ile konjuge olur. </li><li> PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dilim DAPI içeren bir montaj medya kullanarak cam bir mikroskop lamı üzerine monte. </li><li> Sırasıyla 488 nm ve 561 nm eksitasyon dalga boyu Calbindin ve TUNEL kullanarak konfokal mikroskop ile resim dilimleri. </li></ol></li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Bu protokolün temel zorluk, bizim son okuma hücre ölümü olacaktır, özellikle de sağlıklı serebellar dilim kültürlerini oluşturmak için muktedir. Sağlıklı bir kültür, bir hücre gövdesi katmanı saydam olarak görünür ve mikroskop altında beyincik (Şekil 1) yapraklanmış yapısını görmenizi sağlar. Kültür Birkaç gün sonra dilimleri ince ve non-nöronal hücrelerin başlar dilim marjları uzak göç görülebilir. Kültür birkaç gün sonra dilimleri kapsayan koyu renkli yuvarlak hücreler (büyük olasılıkla makrofajlar), sonunda 10-14 gün sonra, in vitro (Şekil 2) 5 sayısı azalacak. Dilim canlılığı için nihai kanıtı Purkinje hücreleri gibi Calbindin gibi farklı hücresel belirteçleri, leke. Şekil 3 Purkinje hücre tabakasının çeşitli TUNEL pozitif çekirdeklerin bir temsilcisi konfokal mikroskop görüntü gösterir. Bazı dilim apoptotik uyaran aldı bile, onlar sadece 24 saat açık olduğunu göz önünde bulundurmak önemlidir. Bu TUNEL boyama ile ölmekte olan hücrelerin DNA parçalanması gözlemlemek için yeterli zaman izin verilir, ancak belirli bir Purkinje hücre tabakası hala mevcut. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. DIV2 Sağlıklı serebellar dilim Bu görüntü, saydam hücre gövdesi tabaka ve sağlıklı bir dilim yapraklanmış serebellar yapı gösterir . <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. DIV 7 Sağlıklı serebellar dilim Bu resimde biz hala serebellum ve karanlık bir hücreye organları görünümünü yapraklanmış yapısı izleyebilirsiniz. <img src="/files/ftp_upload/2564/2564fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Fas tedavi serebellar dilim Temsilcisi görüntü konfokal Bu görüntü Calbindin (yeşil) ve TUNEL boyama (kırmızı) için pozitif apoptotik hücreleri ile boyandı Purkinje hücreleri gösterir. Purkinje hücreleri tek bir satır görünmüyor ama Folium gibi bir yapı oluşturan kümelenmiş.

<ol><li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+fetal+ependymal+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Anat+Rec%22%5BJournal%5D)">Human fetal ependymal cells in tissue cultures.</a> Anat Rec. 99, 523-529 (1947).</li>
<li>Hogue, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+of+studies+of+human+fetal+brain+cells+in+tissue+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Etudes+Neonatales%22%5BJournal%5D)">Review of studies of human fetal brain cells in tissue cultures.</a> Etudes Neonatales. 1, 1-13 (1952).</li>
<li>Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staining+protocol+for+organotypic+hippocampal+slice+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Staining protocol for organotypic hippocampal slice cultures.</a> Nat Protoc. 1, 2452-2456 (2006).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37, 173-182 (1991).</li>
<li>Beat, H., Gähwiler, S. M. T., McKinney, R. A., Debanne, D., Robertson, R. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeat%2C+H+%22Organotypic+Slice+Cultures+of+Neural+Tissue+in+Culturing+Nerve+Cells%22">Organotypic Slice Cultures of Neural Tissue in Culturing Nerve Cells</a>. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. Cambridge. 461-498 (1998).</li>
</ol>

IACUC tarafından belirlenen politikalara uygun olarak yapılan tüm hayvan çalışmaları yapıldı. Salk Enstitüsü&#39;nden AAALAC akredite bir tesistir.

Bu yöntem, nöronal Organotipik kültürlerin birçok olası uygulamalar biri açıklar ve yabani tip ve mutant serebellar dilim apoptotik uyaranların etkisini araştırmak için izin verdi. Bu deneyin en önemli parçası, sürekli olarak sağlıklı serebellar dilim kültürü oluşturmak mümkün olmaktır. Önemli faktörler diseksiyon ve dilimleme tekniği ve mümkün olan en kısa zamanda protokol gerçekleştirme yeteneği, ama aynı zamanda dikkatli dilim zarar görmemesi için. Bir diğer önemli faktör, kültür ortamının hazırlanması ve kompozisyon, bu kültürlerin çok hassastır, bu yüzden biz, medyanın çeşitli yemek tarifleri ve markalar denemek zorunda kaldık. , Serum veya medya herhangi bir diğer bileşenler bile farklı partiler dilim canlılığı etkileyebilir. Biz Invitrogen Lot # 480.116 At Serumu ile en iyi sonuçları var. Serebellar dilim sonra bir serebellar gelişim, elektrofizyoloji, hücre yaşamını tek başına veya apoptotik uyaranlara eksitotoksisitesi veya oksijensizlik yanıt olarak eğitim görebilirsiniz. Yabani tip ve mutant serebellar dilimleri kullanarak karşılaştırmalı çalışmalar serebellar fonksiyon ve gelişiminin pek çok açıdan çok anlayışlı edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>MEM</td><td>Invitrogen</td><td>11090</td><td></td></tr><tr><td>At Serumu</td><td>Invitrogen</td><td>16050</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Invitrogen</td><td>15630</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Invitrogen</td><td>25030</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin/ Streptomisin</td><td>Invitrogen</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Hızlı Yapıştırıcı</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td></td></tr><tr><td>6 kuyucuklu / 24 kuyucuklu hücre kültürü plakaları</td><td>Corning</td><td>3506/ 3527</td><td></td></tr><tr><td>30mm kültür plakası insertleri (0.4-&amp;mu;m gözenek)</td><td>EMD Millipore</td><td>PICM03050</td><td></td></tr><tr><td>Saflaştırılmış NA/LE Hamster anti-mouse CD95 (Jo2)</td><td>BD Biosciences</td><td>554254</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;In situ&lt;/em&gt; hücre ölümü tespit kiti, TMR red</td><td>Roche Group</td><td>12 156 792 910</td><td></td></tr><tr><td>Tavşan anti-Calbindin D-28k antikoru</td><td>Swant</td><td>CB-38a</td><td></td></tr><tr><td>Alexa 488-keçi anti-tavşan IgG sekonder antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A-11008</td><td></td></tr><tr><td>DAPI içeren Vectashield Bağlama Medyumu</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>Diseksiyon Mikroskobu</td><td>Carl Zeiss, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratom</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Konfokal Mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

organotipik serebellar kültürler: apoptotik zorluklar ve tayin

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Nöronal doku Organotipik kültürleri, ilk kez 1947 1,2 Hogue tarafından tanıtıldı ve nörobilim alanında önemli bir atılım teşkil etmiştir . O zamandan beri, bu teknik daha da geliştirilmiş ve henüz Organotipik kültürleri hazırlamak için birçok farklı yolu vardır. Stoppini ve arkadaşları tarafından açıklanan bir uyarlanmış yöntemi burada sundu. Dilimleri hazırlanması ve Gogolla ark. Boyama işlemi 3,4 için. Bu tekniğin eşsiz bir özelliği, tüm hücresel organizasyonu ve nöron ağları bozulduğu olduğu ayrışmış kültürleri üzerinde büyük bir avantaj sağlayarak, kendi özgün yapısı hipokampus ve serebellum gibi beynin farklı yerlerinde çalışmaya olanak veren. Serebellumun durumda Purkinje hücrelerinin çalışma, ayrışmış temel kültür olarak elde etmek için son derece zor izin verdiğinden bile daha avantajlıdır. Bu yöntem, in vitro olarak serebellum bazı gelişimsel özellikleri yanı sıra çalışmada, yabani tip ve mutant fareler hem de elektrofizyolojik ve farmakolojik deneyler için kullanılabilir . Apoptotik hücre ölümü ölçmek için TUNEL boyama yöntemi, burada açıklanan, gelişmekte olan beyincik Fas ligand olarak apoptotik uyaranlara etkisini araştırmak için dizayn edilmiştir. TUNEL boyama gibi Calbindin Purkinje hücreleri için hücre tipi özgül belirteçler ile birlikte ise, bir hücre popülasyonu belirli bir şekilde hücre ölümünü değerlendirmek mümkündür. Calbindin boyama da serebellar kültürlerin kalitesini değerlendirmek amacıyla hizmet vermektedir.

Bu yöntem, Organotipik serebellar kültürlerin üretimi ve farklı serebellar hücre tiplerinin canlılığı belli apoptotik uyaranların etkisi açıklanmıştır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Nöronal dokunun organotipik kültürleri ilk kez 1947 yılında Hogue tarafından tanıtılmış 1,2 ve nörobilim alanında önemli bir dönüm noktasını oluşturmuştur. ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yaban tipi ve mutant farelerin gelişmekte olan serebellumunda apoptotik uyaran fast ligandin etkisini incelemektir. Bu işlem, öncelikle postnatal sekiz ile 12. günler arasındaki yaban tipi ve nakavt farelerin beyinlerinin diseke edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, beyinler 400 µm kalınlığında dilimler halinde kesilir ve her dilimden serebellum izole edilir.Üçüncü adım, fast ligand ile hücre ölümünü indüklemeden önce sağlıklı olduklarından emin olmak için serebellar kesitleri beş gün boyunca kültüre etmektir. Prosedürün son adımı, apoptotik belirteç tunnel için immünofloresan boyama ile birlikte, Purkinje hücreleri için kalbindin gibi hücre tipine özgü belirteçlerin kullanılarak, yabani tip ve knockout farelerin farklı serebellar hücre popülasyonlarında fast ligandın etkisini analiz etmektir. Serebellar canlı kültürlerin temel avantajı, nöronal ağların ve hücresel organizasyonların bozulduğu primer disosiye kültürlerin aksine, serebellar bölgesel yapının korunduğu bir stil sunmasıdır.Bu konu, özellikle yabanıl tip ve mutant farelerin mevcut olması nedeniyle nörobilimdeki bazı temel soruların yanıtlanmasına olanak sağlayacaktır. Böylece karşılaştırmalı gelişim, fizyoloji ve ayrıca elektrofizyoloji ile farmakoloji çalışmaları yapılabilir. Bu yöntem, serebellar hücre sağkalımında fast ligandın işlevine dair bilgiler sağlayabildiği gibi, korteks ve hipokampustaki fast ligand etkilerinin incelenmesinde de kullanılabilir.Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayabilirler; çünkü sağlıklı serebellar lizis elde etmek için, bütünlüklerini bozmadan onları mümkün olan en kısa sürede kültüre almak kritik önem taşır. Bu nedenle, tüm süreci uygulamaya çalışmadan önce iyi diseksiyon ve dilimleme becerilerine sahip olmak önemlidir. Mümkün olan durumlarda.Aşağıdaki prosedürün adımları, disseksiyon öncesinde bir doku kültürü kabininde gerçekleştirilmelidir. Beyin disseksiyonu ve kesit hazırlığı için A CSF ortamı ile kesit kültür ortamını yazılı protokole göre hazırlayın ve disseksiyon gününde dört derece Celsius'ta saklayın. Serebellar kesitlerin kültürü için doku kültürü plakalarını hazırlayın.Altı kuyucuklu bir plakadaki her bir kuyucuğa bir mililitre dilim kültür medyumu ekleyin. Ardından, steril pensler kullanarak kültür plağı insertlerini her birinin içine yerleştirin. Insertlerin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olun.Besiyerini ön koşullandırmak için kültür plağını 37 °C ve %5 karbondioksit değerlerine ayarlanmış bir doku kültürü inkübatöründe en az iki saat bekletin. Ardından, buz gibi soğuk CSF besiyerini karbogen gazı ile kabarcıklayın; besiyerinin karbogen ile doyurulması çözeltinin pH değerini değiştirir ve rengin kırmızıdan turuncuya dönmesini sağlar.Steril bir Petri kabına ve altı kuyucuklu bir plakaya buz gibi soğuk, havalandırılmış A CSF medyasından bir miktar dökün. Bunları, beyni dilimlemek için kullanılacak vibratomen plağıyla birlikte buza yerleştirin. Havalandırılmış buz gibi soğuk A CSF medyası içeren Petri kabı, diseksiyon sonrası P 8 ila P 12 arasındaki fare yavrusundan beynin çıkarılması için kullanılacaktır.Vibrasyon plakasına monte etmek için düz bir yüzey oluşturmak amacıyla, bir hemisferde jilet kullanarak sagital bir kesi yapın. Korteksin rostral kısmı da kesilebilir. Soğutulmuş vibrasyon plakasını kağıt havlu ile kurulayın.Ardından, sahneye bir miktar hızlı yapıştırıcı ekleyin ve yapıştırıcı tüpünün ucuyla zikzaklar çizerek yayın. İnce bir yapışkan tabaka oluşturmak için bir spatula kullanarak, beynin düzleştirilmiş tarafı hızlı yapıştırıcıya temas edecek şekilde beyni vibrato sahnesine aktarın. Beyin vibrasyon plakasına sabitlendikten sonra, beyni örtecek kadar A CSF medyumu ekleyin ve plakayı soğuk tutmak için altına buz yerleştirin.Beyni 400 mikrometre kalınlığında dilimlere ayırın. Ardından, diseksiyon mikroskobu altında çalışarak, uç kısmı kesilip genişletilmiş plastik bir pasta pipeti yardımıyla dilimleri buz üzerinde bulunan A CSF ortamı içeren altılı kuyucuk plakasuna aktarın.Serebellumu beynin geri kalanından ayırmak için küçük çaplı 28 gauge iğnelere sahip iki adet insülin şırıngası kullanın. Eğer dilimlerin kenarlarında hızlı yapıştırıcı varsa, yapıştırıcıyı dilimden temizlemek için iki şırınga iğnesini kullanın. Dilimleri filtrelerin üzerine aktarmak için ucu kesilerek genişletilmiş plastik pasta pipeti kullanın.İnsert başına bir ila üç dilim eklemek, dilimlerin tamamen açılmasını ve üzerlerinin sıvıyla kaplanmamasını sağlar. Gerektiğinde, fazla medyumu pipetle aspire edin ve 37 °C ve %5 karbondioksit içeren inkübatörde 48 saat bekletin. 48 saat sonra, insertin altında hava kabarcığı kalmadığından emin olarak medyum hacminin yarısını taze medyum ile değiştirin.Geriye kalan orijinal besiyeri, hücre sağkalımı için önemli olan dilimlenmiş türev trofik faktörler içerir. Apoptotik uyarı, beş günlük kültürleme süresinin ardından gerçekleştirilir. İşlem yapılacak kuyruklardaki hücre kültür besiyerine hızlı agonistik antikor JO iki ekleyin.Kuyucukların yarısını kontrol olarak işlemeden bırakın. 24 saat geçtikten sonra, kuyucukların altındaki medyumu aspire edin. Ardından, insertin altına bir mililitre buz gibi soğuk %4 paraldehit ve insertin üzerine bir mililitre PFA pipetleyerek kesitleri fikse edin.Kesitlerin PFA içinde, önce 10 dakika oda sıcaklığında fiksasyon yapmasına izin verin. PFA'yı aspire edin ve iki mililitre soğuk PBS ile pipetleyerek kısaca yıkayın. Bir mililitreyi insertin üzerine ve bir mililitreyi insertin altına ekleyin.Ardından, PBS'yi aspire edin; insertin altına bir mililitre PBS içinde %20 buz gibi soğuk metanol ve insertin üzerine bir mililitre ekleyin. Oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin, ardından kuyucuktaki %20 metanolü aspire edin ve kesiti ve D kuyucuğunu PBS ile yıkayın. Daha önce yapıldığı gibi, insertin üzerine bir mililitre PBS içinde %0,5 Triton X 100 ve insertin altına bir mililitre daha ekleyin.Permeasyon işleminin ardından kesitleri geçirgen kılmak için en az 12 saat boyunca 4 °C'de inkübe edin. PBS içindeki %0,5 Triton X 100'ü aspire edin ve kesitin üzerine bir mililitre, altına ise bir mililitre PBS içindeki %20 BSA ekleyin. Kesitleri oda sıcaklığında en az dört saat veya 4 °C'de gece boyunca bloklayın.Bloklama işlemi tamamlandığında, temiz bir makas kullanarak serebellar kesite iliştirilmiş membran insert parçasını dikkatlice kesin. Ardından, temiz bir penset yardımıyla membran parçasını PBS içeren 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın; PBS'yi aspire edin ve her bir kuyucuğa 250 µL tunnel reaktifi ekleyin. Reaktifin kesitin tüm yüzeyini kapladığından emin olun.Karanlıkta 37 °C'de bir saat boyunca inkübe edin; süre dolduğunda, kuyucuklardaki tünel reaktifini aspire edin ve yerine 500 µL PBS ekleyin. Plakayı ışıktan koruyun ve yıkama işlemi için oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin.Bu işlemi son yıkamadan sonra iki kez tekrarlayın. PBS'yi aspire edin, PBS içerisinde 1:1000 oranında dilüe edilmiş 250 microliter calbindin antikorunu ekleyin ve 4 °C'de karanlıkta gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün.Primer antikor solüsyonunu aspire edin ve PBS ile 10 dakika boyunca 3 kez yıkayın. Ardından, PBS içinde 1:500 oranında seyreltilmiş 250 µL sekonder antikor ekleyin. Işıktan korumak için plakayı alüminyum folyo ile kapatın ve oda sıcaklığında en az üç saat boyunca inkübe edin.Kesitleri PBS ile 10 dakika boyunca üç kez yıkayın ve dappy içeren bağlama medyası kullanın. Kesitleri bir cam mikroskop lamı ve kapatma camı üzerine bağlayın. Kesitleri, sırasıyla kale, bendin ve tunnel için 488 nanometre ve 561 nanometre eksitasyon dalga boylarını kullanarak konfokal mikroskop ile görüntüleyin.Bu görüntü sağlıklı bir serebellar kesiti göstermektedir. İn vitro ortamdaki ikinci günün ardından, hücre gövdesi tabakası yarı saydam görünmekte ve serebellumun foliye yapısı mikroskop altında net bir şekilde görülmektedir. İn vitro ortamdaki yedinci günün ardından, sağlıklı serebellar kesitin foliye yapısı hâlâ görünür durumdadır.Ek olarak, muhtemelen makrofajlar olan koyu renkli hücre gövdeleri genellikle kesiti kaplar. Burada görülen konfokal görüntü, fast ile işlem görmüş bir serebellar kesiti temsil etmektedir. Bikini hücreleri, primer antikor ile boyamanın ardından Alexa 4 88 konjuge ikincil antikor uygulandıktan sonra yeşil görünmektedir.Kullanılan TUNEL kiti TMR ile işaretlendiği için, TUNEL boyamasına pozitif apoptotik hücreler kırmızı görünür. Kırmızı Bikini hücreleri tek bir sıra halinde değil, bu prosedürü uygularken kümelenmiş benzeri bir yapı oluşturacak şekilde görünür. Mümkün olan her durumda doku kültürü kabininde çalışmak ve serebral dokunun bakteri veya mantar gibi olası kontaminanlara maruz kaldığı süreyi en aza indirmek önemlidir.Bu prosedür kullanılarak, protein içeriğinin yanı sıra nöronal uyarılabilirlik hakkında ek bilgiler sağlamak amacıyla biyokimya ve elektrofizyolojik analizler dahil olmak üzere diğer yöntemler de bu kesitlere uygulanabilir. Bu teknik, başlangıçta hızlı yolak üzerinden gerçekleşen hücre ölümünün etkisini, hızlı yolağı etkileyen mutasyonlar taşıyan Perkin hücrelerinde incelemek için geliştirilmiştir. Perial hücreleri primer kültürde nadiren hayatta kalır.Bu prosedür, en iyi deneysel yaklaşım olmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, serebral korteks dilimlerinin nasıl hazırlanacağı ve apatik uyaranların farklı serebral hücre tipleri üzerindeki etkilerinin nasıl çalışılabileceği konusunda iyi bir fikir edinmiş olacağınızı umuyorum.

organotypic-cerebellar-cultures-apoptotic-challenges-and-detection

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Kaspaz 3 aracılı apopitoz ölümsüzleştirdi N19 oligodendrosit hücre kültürleri Canlı hücre görüntüleme...

İzleme bölünmüş Kaspaz-3 Aktivite ve Potasyum kaynaklı Membran depolarizasyon Canlı hücre Görüntüleme ve Cleaveable EPA-boya Substratlar ölümsüzleştirdi oligodendroglial Hücre Apoptoz

Biz organotipik serebellar dilim kültürlerde yetişen bireyin Purkinje hücre dendritik ağacın morfolojisi görüntülemek ve kantitatif tayini için izin veren bir protokol mevcut. Bu protokol, Purkinje dendritik hücre gelişme mekanizmaları üzerinde çalışmalar teşvik etmek için tasarlanmıştır.

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Bu video, bir fare yavrusunun beyninden serebellar organotipik dilimler elde etmek ve bu dilimleri in vitro  serebellar gelişimi taklit etmek için besinler ve büyüme faktörleriyle desteklenmiş ortamda kültürlemek için bir tekniği göstermektedir.Ek olarak, spesifik serebellar dilimler bir test bileşiği ile muamele edilir ve bileşiğin nöroprotektif yeteneği bir immünofloresan boyama tekniği kullanılarak analiz edilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerinde Purkinje Hücre Sağkalımının Analizi

Bu video, canlı nöronların yeşil ve ölü nöronların kırmızı göründüğü floresein diasetat (FDA) ve propidyum iyodür (PI) ile ikili boyama kullanarak karışık bir serebellar granül nöron ve glial hücre kültüründen nöronları tanımlama yöntemini gösterir.

Bir Serebellar Nöron Kültüründe Çift Boyama ile Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Serebellar dış granül tabakası gelişmekte olan beyinde büyük Transit amplifikasyon sitedir. Burada, embriyonik Gün 14 civciv embriyolardan ex vivo elektroporasyon ve serebellar dilim kültürü kullanarak çoğalması zirvesinde bu tabakaya genetik modifikasyon hedeflemek için bir protokol mevcut.

Ex Vivo Chick Serebellar Dilimleri Kültür ve Mekansal Elektroporasyon granül hücre öncülerinin Hedefli

Bu protokol, nörobilim ve nörofarmakoloji araştırmalarında in vitro bir model olarak kullanılan birincil nöronal kültür olan kültürlenmiş serebellar granül nöronlarında Fluorescein diasetat (FDA) ve Propidyum İyodür (PI) çift boyasını kullanarak nöronal canlılığı nasıl doğru bir şekilde ölçtüğümü açıklamaktadır.

Serebellar Granül Nöron Kültüründe Floresan Diasetat-Propidyum İyodür Çift Boyama Kullanarak Nöronal Canlılığın Değerlendirilmesi

Bu iletişim kuralı yalıtma ve birincil fare serebral granül neurons (CGNs) 6-7 gün eski pups, CGNs kaybı için verimli iletim ve kazanç işlevi çalışmalar, kültür ve nöronal excitotoxicity NMDA kaynaklı modelleme için basit bir yöntem açıklar, düşük potasyum indüklenen hücre ölümü, DNA hasarı ve oksidatif stres aynı kültür modelini kullanarak.

Modelleme nöronal ölüm ve fare birincil serebellar granül nöronlar dejenerasyon

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

In vitro deneylerin vivo koşullarını mümkün olduğunca yeterli şekilde yansıtmak için yapılması kolay bir iş değildir. Birincil hücre kültürlerinin kullanımı bütün bir organizmada hücre biyolojisini anlamaya yönelik önemli bir adımdır. Sağlanan protokol nasıl başarılı bir şekilde büyümek ve kültür embriyonik fare serebellar nöronlar özetliyor.

Embriyonik Fare Beyincisinden İzole Edilen Nöronların Birincil Kültürü

Organotipik dilim kültürleri nörogelişimsel veya dejeneratif /rejeneratif süreçleri incelemek için güçlü bir araçtır. Burada, fare serebellar dilim kültürlerde Purkinje hücrelerinin nörogelişimsel ölüm modelleri bir protokol açıklar. Bu yöntem nöroprotektif ilaç keşfinde araştırma yada yararlı olabilir.

Organotipik Serebellar Dilim Kültürlerde Purkinje Hücre Sağkalım

Serebellar Purkinje hücreleri (PC'ler), DNA hasar yanıtındaki eksikliklere karşı özellikle hassastır. SEREBELLAR organotipik kültürler içinde proteine bağlı poli (ADP-riboz) zincirlerinin boyanmasını içeren, DNA hasarına PC yanıtının dinamiklerinin görsel olarak değerlendirilmesi için bir protokol sunulmuştur.

Serebellar Organotipik Kültürler Kullanılarak Purkinje Hücrelerinde DNA Hasar Yanıtının Görüntülenmesi

Öğrenin, organotipik serebellar kültürlerde apoptotik zorlukların etkilerini farelerde incelemeyi. Bu yöntem, serebellar hücre canlılığını ve gelişimsel farklılıkları analiz etmek için kullanılır.

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Daha fazla video keşfet