Name: Gangliyonik Eminence Kültürler oluşturuldu Hücre Göçmen Davranış (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-21T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 34 s
Description: Öğrenin gangliyonik eminans hücrelerinin göç davranışlarını 3D doku kültürleri ve zaman atlamalı görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem, sinir sistemi gelişimi araştırmalarında bireysel hücre hareketlerini gözlemlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, DoD Hibe PT074620 (SLJ) ve NIH Hibe R01NS245014 (SLJ) tarafından desteklenmiştir.

1. Reaktif hazırlama <ol><li> Çözülme, ıslak buz üzerinde deneyi (aktif ısınma sürecini hızlandırmak) önce yeterli zaman bırakarak Matrigel dondurulmuş Matrigel hücrelerin göç için elverişli bir ekstrasellüler matriks yakından benzeyen 3 boyutlu bir ortam oluşturmak için kullanılır. Bu bir substrat hem de mekanik encasing hücreleri sağlar. Matrigel -20 ° C'de dondurularak saklanmalıdır Kullanmadan önce, yavaş yavaş sıcaklığını 0-4 büyümüş olmalı ° C, yani ıslak buz üzerinde veya bir buzdolabı çözülmüş. Matrigel geri dönüşümsüz inkübasyon sıcaklığı (37 ° C) bir jel formu için ayarlar. Bu nedenle, sıcak su konteyner çeker çözülme hızlandırmak için tavsiye edilmez . </li><li> Protein fraksiyonları, doğum sonrası günlük 0 (P0) gelincik serebral korteks total protein ekstresi izoelektrik odaklama (IEF) tarafından hazırlanmıştır. Ayrıldıktan sonra, kesirler 20mm Tris-HCl pH7.2 karşı doku için toksik olabilir odaklama tampon bileşenler, özleri temiz bir gecede diyalize vardır. </li><li> Serebral korteks çıkarılan Protein dağıtım sistemi. Proteinler, sonra yavaş yavaş floresan özellik mikroküreler görsel işleme yardımcı olur ve site bile minimal yayılımı kolay algılanmasını sağlar bulundu environment.We proteinler serbest floresan lateks boncuk adsorbe boncuk mevduat, floresan mikroskop altında gözlenen. <ol class="lalpha"><li> 10μl, floresan boncuk protein solüsyonu 100-200μl ekle </li><li> Çalkalayıcı üzerinde RT karanlıkta 30 dakika inkübe </li><li> Maksimum hızda 1sa bir tezgah santrifüj boncuk Spin </li><li> Süpernatantı </li><li> Taze orta 10μl kullanarak bir vorteks yeniden askıya </li><li> Süspansiyon Matrigel, 30μl ekleyin, iyice karıştırın ve buz üzerinde yer. </li></ol></li><li> Tamponlar ve medya <ol><li> Yapay beyin omurilik sıvısı (NaCl 124mm, NaHCO 3 26mm, NaH 2 PO 4 1.2mm, KCl 3.2mm, MgSO 4 1.2mm, CaCl 2 2.4mm, Glikoz 10mM aCSF) hazırlayın ve filtrasyon sterilize. Önceden aCSF Slush dondurma, böylece doku diseksiyonu zamanda hazır olmak için, -80 ° C derin dondurucuda steril aCSF ile dolu bir plastik şişeyi koyun. Duvarın içine kadar buz tabakası oluşturur, onu kırmak ve sıvı ile karıştırın, çok sık her dondurma izleyin. Balondaki çoğunlukla buzlu sulu kar içerir kadar tekrarlayın. Tampon sadece doku hayatta kalma destekler bu şekilde hazırlanmış, fakat düşük sıcaklıkta uzun süre tutacak ve tıknaz buz küpleri daha doku mekanik olarak daha az zararlı. </li><li> N-2 ve B-27 takviyesi, üreticinin önerileri yanı sıra 1mg/100ml gentamisin, 2 mM L-glutamin ve% 0.6 glukoz doğrultusunda ekledi. Neurobasal ortamı hazırlayın 0.22μm zarından filtrasyon ile sterilize edin. 37 sıcak tutun ° C kullanana kadar. </li></ol></li><li> Kültür plakalar <ol class="lalpha"><li> Kültür dereceli plastik altı kuyucuğu 20μl pipet kullanarak soğuk Matrigel küçük bir miktarı (2μl hakkında) ile merkezi her yanı süsleyen ve her damla otoklavlanmış yuvarlak 18mm cam lamel yerleştirerek tarafından hazırlanmıştır. Ne plakaları ne lamelleri aksi kültür tedavi gerekir. </li></ol></li></ol> 2. Doku hazırlanması <ol><li> Beyin dokusu elde etmek <ol class="lalpha"><li> Derin anestezi ile hayvan Euthasol sonra, beyin kaldırmak ve buz aCSF </li><li> Bir neşter hemisferlerin ayırın ve küçük bir çanak içine buz aCSF içeren bir dilim toplama, koronal dilim tercih edilen bir cihaz kullanarak 500μm </li></ol></li><li> Yapma eksplantlar (diseksiyon mikroskop kullanmak) <ol class="a"><li> GE üzerinde kıvrılma ve daha ileri adımlar müdahale ganglion eminences (GE) ve korteks Döşeme bölgeleri içeren dilimleri belirleyin </li><li> Harris Uni-Core basın GE ventriküler yüzeye yakın alanda deliği, ağırlıklı olarak ventriküler dilimini içeren bir çekirdek geri çekmek ve buz orta (Şekil 1) bir piston ile sınırdışı 0.5 Üç dört eksplantlar mm çapında tek P0 gelincik beyin dilim GE yapılabilir. Hem kemirgenler ve dağ gelinciği, medial ve lateral GES bu yaşta erimiş olduğunu lütfen unutmayınız. Çekirdek bir dilim kalır ya da yemeğin plastik altına sıkışmış ise, soğuk Neurobasal orta içeren çanak içine bir pipet ile bir pipet ve transfer ile aCSF püskürtme seferber . Islak buz üzerinde çanak tutun. </li><li> Eksplantlar tam dalmış ve kabarcıkları kaçınarak özen, ayrı bir kapta, yerleştirilen buz Matrigel büyük bir damla (yaklaşık 0.25-0.5 ml) orta eksplantlar toplu aktarın. Islak buz üzerinde çanak tutun. Bir toplu iş boyutu, iş akışı akış aşağı hızına bağlıdır. </li></ol></li></ol> 3. Kültür kurulumu (diseksiyon mikroskobu kullanın) <ol><li> Daima Matrigel kür önlemek için buz üzerinde Matrigel içeren karışımları tutun. </li><li> Remix boncuk süspansiyonu ve 20μl bir pipet kullanarak daha önce bir kültür plaka yerleştirilmiş bir cam lamel merkezinde buz Matrigel boncuk süspansiyon 1-2μl veya daha az. Bir küçük set, kurutma kaçının. </li><li> 20μl bir pipet kullanarak Matrigel açılan 2 eksplantlar pick up ve ters tarafta simetrik (depozito kenarından uzak 1mm en azından) boncuk mevduat istenen çevresinde koyun. 5dk daha oda sıcaklığında artık ayarlamanıza olanak sağlar. B ve c adımları doğru zamanlama kritik öneme sahiptir. Süresi çok kısa ise Matrigel son tabakası ile kaplıdır hareket edecek, kültür kurulum eksik jelleşme ve bileşenleri yol açacaktır; süresi çok uzun ise, jel ve yaratılış üzerinde kuruyan neden olabilir hücreleri serbest dolaşımı engelleyen fiziksel bariyerler. </li><li> Eksplantlar (Şekil 2) ötesinde uzanan yaklaşık 30μl Matrigel, düz bir tabaka ile boncuk ve eksplant örtün. Yaklaşık 15 dakika süreyle inkübatör ayarlanmış olsun. </li><li> Takviyeleri ile Neurobasal orta 2 ml ekleyin. </li><li> Günlük 37 ° C,% 5 CO 2 /% 95 O 2 izleme göç aktivitesi inkübe edin. </li></ol> 4. Canlı görüntüleme <ol><li> 3-4 gün inkübasyondan sonra, kültür plakaları gözden geçirin ve ilgi lamelleri seçin. Eksplantlar hücre radyal tekdüze bir bulut oluşturmak gerekir. Canlı görüntülemede kullanılacak olan yeni bir kültür plakasına seçilen lamelleri değiştirin. </li><li> Lamelleri yeni plaka gece boyunca bekletin. Görüntüleme için mikroskop plaka yerleştirmeden önce, hücre kültürü kaputu lamel, lamel ve hücre kültürü plakası arasındaki toplamak herhangi bir mikro kabarcık serbest bırakmak amacıyla hareket etmek için steril bir spatula kullanın. Baloncuklar Girişim görüntüleri berbat. Lamelleri iyi merkezine taşıyın. </li><li> Buharlaşmasını önlemek için, su ile kuyu arasındaki boşluğu doldururlar. </li><li> Iyi merkezinde lamelleri hareket olarak mikroskop hücre kültürü kaputu plaka dikkatli bir şekilde aktarmak. </li><li> Görüntüleme yazılımı kullanarak bir görüntüleme sistemini tanımlayın. Hücrelerin kültür kurulum 3D doğası nedeniyle de dikey hareket, bu nedenle göç bulutun tam derinliği kapsayan Z bilgi toplamak için önemlidir. Görüntülü alanı XY ölçüde de göreli bir eksplant açısal yönelim ve göç hücreleri kaydetmek için, kayıt sırasında göç eden hücreler tarafından doldurulur tahmin alanları kapsayacak şekilde ve boncuk depozito içeren set yeterince büyük olmalı protein kaynağıdır. Ayrıca görüntülü Z uçaklar, ya da daha fazla alan arasında daha uzun zaman aralıklarında örnekler ve hücre izleme temporal çözünürlük kaybına zorlayarak, belli bir zaman noktasında bir döngü kayıt için gereken daha fazla zaman kapsadığını düşünün . Bizim durumumuzda, 10x objektif kullanarak, en uygun düzeni her 10 Z-uçakları, 30 dakika aralıklarla her 20μm aralıklı için 3x3 kiremit kayıt edildi. Biz 30 dakika aralıklarla hareketlerinin güvenilir bir izleme için kritik öneme sahiptir kez puan, hücrelerin kesin kimlik izin veren uzun bulundu . </li><li> Zaman atlamalı görüntüleme başlatın. </li><li> Istenen süre sonra, plaka kaldırmak ve fosfat tamponlu paraformaldehid% 4 kültürler düzeltmek. Bu morfolojik ve immünositokimyasal analizi için kullanılabilir. </li></ol> 5. Hareket Analizi <ol><li> Daha fazla işlem için en uygun bir biçimde, TIFF en taşınabilir görüntülerin kayıt süresi serisi dönüştürün. </li><li> Zamanla kayıt XY koordinatları ile tek tek hücrelerin hareketini izleyin. Manuel İzleme plug-in ya da ImagePro VOLICITY veya AutoQUANT başka herhangi bir ticari uygulama ile ImageJ (NIH) gibi serbestçe kullanılabilir yazılım kullanılarak yapılabilir. </li><li> Excel ya da in-house geliştirilmiş yazılım kullanarak izleri çizilir. </li><li> Takip her hücre, ortalama hız, yol eğrilik, zaman içinde yön değişkenlik, dallanma, protein kaynağı doğru sapma gibi kinetik parametreleri hesaplamak için, vb Hesaplamalar MS Excel veya eşdeğer herhangi bir tablo yapılabilir . Onlar daha sofistike analitik yöntemlerin dışında, daha esnek özelleştirme ve dahil edilmesi için izin Deneyimlerimiz, ancak içi scriptleri (R, Matlab, Python, Perl veya diğer çoğunlukla Open Source dilleri kullanarak) geliştirmek için çok daha verimli olduğunu gösterir Excel'in temel bir kurulum mevcuttur. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Anatomik uydu alıcısı diyagramın eksplant. Bu hemisected bir gelincik beyin koronal dilim bir çizim. Gri daireler eksplantlar alındığı bölgeye işaret etmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 bir kültür kurulum Diyagramı. Boncuk mevduat proteinlerin kaynağıdır; eksplantları iki tarafına yerleştirilir ve tüm unsurları Matrigel kaplıdır. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Kadran (boncuk mevduat doğru oklar noktası) tarafından renkli hücre parça Sorumlu araziler. Sağdaki hücre parçaları hücreleri çekmek için görünür fraksiyonu-Ge, doğru geçiriyorsanız; soldaki hücreleri göç hücreleri geri püskürtmek için görünür fraksiyonu, doğru göç. <img src="/files/ftp_upload/2583/2583fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. A) bir eksplant dışına göç eden hücreler büyüyen bir bulut gösteren seçilmiş timepoints görüntüleri bir dizi. (Ölçek çubuğu 200μm) aşağıda gösterildiği gibi bir ok ile gösterilen bir örnek hücre, zaman içinde izlenir. Bu eksplant 38 saat canlı görüntüleme ile görüntülendi B) Hücre zaman bir belirtilen bölümünde belirtilen nihai görüntü görüntüleri kayıt başından itibaren eksplant bırakarak hücrelerin görüntülerini burada gösterilir. Hücre tekrarlayan dallanma gösterir (ölçek çubuğu 50μm).

<ol><li>Caviness, V. S. Jr, Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cortical+development%3A+a+view+from+mutations+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cortical development: a view from mutations in mice.</a> Annu. Rev. Neurosci. 1, 297-326 (1978).</li>
<li>Gelman, D. M., Martini, F. J., Nóbrega-Pereira, S., Pierani, A., Kessaris, N., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+embryonic+preoptic+area+is+a+novel+source+of+cortical+GABAergic+interneurons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The embryonic preoptic area is a novel source of cortical GABAergic interneurons.</a> J. Neurosci. 29, 9380-9389 (2009).</li>
<li>Hasling, T. A., Gierdalski, M., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+radialization+factor+in+normal+cortical+plate+restores+disorganized+radial+glia+and+disrupted+migration+in+a+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">A radialization factor in normal cortical plate restores disorganized radial glia and disrupted migration in a model of cortical dysplasia.</a> Eur. J. Neurosci. 17, 467-780 (2003).</li>
<li>Hirschberg, A., Deng, S., Korostylev, A., Paldy, E., Costa, M. R., Worzfeld, T., Vodrazka, P., Wizenmann, A., Götz, M., Offermanns, S., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+deletion+mutants+reveal+a+role+for+semaphorin+receptors+of+the+plexin-B+family+in+mechanisms+underlying+corticogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene deletion mutants reveal a role for semaphorin receptors of the plexin-B family in mechanisms underlying corticogenesis.</a> Mol. Cell Biol. 30, 764-780 (2010).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Riding+the+glial+monorail%3A+a+common+mechanism+for+glial-guided+neuronal+migration+in+different+regions+of+the+developing+mammalian+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Riding the glial monorail: a common mechanism for glial-guided neuronal migration in different regions of the developing mammalian brain.</a> Trends Neurosci. 13, 179-184 (1990).</li>
<li>Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Central nervous system neuronal migration.</a> Annu. Rev. Neurosci. 22, 511-539 (1999).</li>
<li>Liodis, P., Denaxa, M., Grigoriou, M., Akufo-Addo, C., Yanagawa, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lhx6+activity+is+required+for+the+normal+migration+and+specification+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Lhx6 activity is required for the normal migration and specification of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 27, 3078-3089 (2007).</li>
<li>Métin, C., Alvarez, C., Moudoux, D., Vitalis, T., Pieau, C., Molnár, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+pattern+of+tangential+neuronal+migration+during+forebrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Conserved pattern of tangential neuronal migration during forebrain development.</a> Development. 134, 2815-2827 (2007).</li>
<li>Martini, F. J., Valiente, M., López Bendito, G., Szabó, G., Moya, F., Valdeolmillos, M., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biased+selection+of+leading+process+branches+mediates+chemotaxis+during+tangential+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Biased selection of leading process branches mediates chemotaxis during tangential neuronal migration.</a> Development. , 136-1341 (2009).</li>
<li>Nóbrega-Pereira, S., Kessaris, N., Du, T., Kimura, S., Anderson, S. A., Marín, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Postmitotic+Nkx2-1+controls+the+migration+of+telencephalic+interneurons+by+direct+repression+of+guidance+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Postmitotic Nkx2-1 controls the migration of telencephalic interneurons by direct repression of guidance receptors.</a> Neuron. 59, 733-745 (2008).</li>
<li>Pearlman, A. L., Faust, P. L., Hatten, M. E., Brunstrom, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+directions+for+neuronal+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">New directions for neuronal migration.</a> Curr. Opin. Neurobiol. 8, 45-54 (1998).</li>
<li>Poluch, S., Jablonska, B., Juliano, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+interneuron+migration+in+a+ferret+model+of+cortical+dysplasia%5BTitle%5D)+AND+%22Cereb+Cortex%22%5BJournal%5D)">Alteration of interneuron migration in a ferret model of cortical dysplasia.</a> Cereb Cortex. 18, 78-92 (2008).</li>
<li>Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+neural+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Experientia%22%5BJournal%5D)">Principles of neural cell migration.</a> Experientia. 46, 882-891 (1990).</li>
<li>Riddle, D. R., Katz, L. C., Lo, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Focal+delivery+of+neurotrophins+into+the+central+nervous+system+using+fluorescent+latex+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Focal delivery of neurotrophins into the central nervous system using fluorescent latex microspheres.</a> Biotechniques. 23, 928-937 (1997).</li>
<li>Wichterle, H., Alvarez-Dolado, M., Erskine, L., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permissive+corridor+and+diffusible+gradients+direct+medial+ganglionic+eminence+cell+migration+to+the+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">Permissive corridor and diffusible gradients direct medial ganglionic eminence cell migration to the neocortex.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 727-732 (2003).</li>
<li>Xu, Q., Cobos, I., De La Cruz, E., Rubenstein, J. L., Anderson, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+of+cortical+interneuron+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origins of cortical interneuron subtypes.</a> J. Neurosci. 24, 2612-2622 (2004).</li>
</ol>

Hayvan kullanımı: hayvanları da içeren tüm prosedürler USUHS ve NIH kurumsal yönergeler doğrultusunda gerçekleştirilen ve USUHS IACUC tarafından kabul edildi.

Burada kimyasal uyaranlara yanıt olarak sinir hücrelerinin göç davranışlarını incelemek ve analiz etmek için basit bir sistem sunuyoruz. In vitro göç deneyleri, hücre lokomosyon etkileyen ekstrasellüler molekülleri tanımlamak için kullanılır olmuştur . Paradigma, incelenen her bir hücre ile etkileşim kurmak için 3 boyutlu (3D) ortamında sahip olmasını sağlar. Ekstrasellüler matriks (örneğin Hirschberg ve ark &#39;10 ile etkileşim dolayısıyla yoksun, poli-D-lizin kaplı lamel düz bir yüzey üzerinde hareket etmek zorunda hücreleri eksplant göçmen kültürleri üzerinde önemli bir avantaj; 8. Metin ve ark. &#39;07). Ancak hücreleri dikey, yatay özgürlüğü göre, alt kısmında bulunan cam lamel ve nispeten ince Matrigel, üst yüzeyi arasındaki boşluk kısıtlı olarak izleme göç hücrelerinin büyük ölçekli saygı, 2-boyutlu kalır göç. Böyle bir kurulum hala esas olarak 2-boyutlu kalır, daha kolay hareket analizi sağlar. Martini ve ark; GE eksplantlar veya kollajen veya Matrigel gömülü GE hücrelerinin yeniden agrega oluşan Benzer 3D paradigmalar, daha önce, hücrelerin kimyasal ipuçları (örneğin Liodis ve ark &#39;07 kaynağı olarak belirli bir sinyal protein ifade agrega kullanılarak istihdam edildi al &#39;09. Nóbrega-Pereira ve arkadaşları &#39;08; Wichterle ark &#39;03). Burada sunulan yöntem, proteinleri orta doğrudan eklenen daha yüksek olan yerel çevre, sürdürülebilir bir düzeyde, izin sistemi, özellikle uygun hale yapıştırılır proteinleri ile lateks boncuk şeklinde yavaş salınımlı sistemi kullanır mevcut miktar protein proteinlerin karmaşık bir karışımı test zaman sınırlı veya. Boncuk seçim lateks bazlı ürünler sınırlıdır ve diğer malzemeler, örneğin agaroz boncuk, her biri farklı özelliklere sahip. Testinin yoğunluğu daha da artırmak için, biz iki zıt tarafta boncuk mevduat apposed eksplantlar kullandı. Kökenli belirli bir alan sağlamak için, biz, bir hücre kaynağı olarak ganglion eminens eksplantlar var. Biz ganglion eminens medial ve lateral kısımları farklılıklar değerlendirildi, ancak herhangi bir farklılık görmedim. Biz bu çalışmada ferrets kullandığı işaret etmelidir; bu türün medial ve lateral ganglion eminences (. Poluch ve ark &#39;08) kemirgenlerde daha önce sigorta. Kültürleri yapıldığı zaman (P0), medial ve lateral ganglion eminences neokorteks doldurmamak birçok hücre, halen üretilen ve göç ediliyor olsa da, erimiş. Ancak gerçek anlamda homojen bir hücre kaynağı tercih edilir, bir hücre süspansiyonu disseke doku hazırlıklı olmak ve doğrudan Matrigel ile karışık, ya da alternatif olarak aşağı doğru bükülmüş ve çıkan pelet &#39;eksplantlar&#39; yapmak için yumrukladı. Proteolitik aktivite bile kalan izleri deney boyunca Matrigel sıvılaştırılması için enzimatik doku sindirim hücre süspansiyonu hazırlamak için kullanımı önerilmez. Ayrıca, due diligence, kültür kurulum zamanlama uygulanacak. Matrigel ısınmanın bir dönemde, hatta biraz daha uzun süre kurutma hava nedenleri ve sonuçları göç hücreleri aşılmaz ve silinemez hangi bir kabuk Matrigel küçük damla maruz kalma (Bu protokolde kullanılan) polimerize gerektirmesine rağmen taze Matrigel sonraki kaplayarak.

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </td><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> Neurobasal Orta (1X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 21103-049 </td><td></td></tr><tr><td> N-2 Eki (100X), sıvı </td><td> Invitrogen </td><td> 17502-048 </td><td></td></tr><tr><td> Ek B-27 (50X) </td><td> Invitrogen </td><td> 0080085-SA </td><td></td></tr><tr><td> BD Matrigel Bodrum Membran Matrix </td><td> BD Biosciences </td><td> 354234 </td><td></td></tr><tr><td> Harris Uni-Core, 0.5mm boyutu </td><td> Elektron Mikroskopi Bilimler </td><td> 69036-05 </td><td> Punch delik </td></tr><tr><td> Yeşil Retrobeads IX </td><td> Lumafluor, Inc. </td><td></td><td> Lateks mikroküreler </td></tr></tbody></table>

gangliyonik eminence kültürler oluşturuldu hücre göçmen davranış

Migratory Behavior of Cells Generated in Ganglionic Eminence Cultures

Hücre göçü, omurgalı ve merkezi sinir sisteminin gelişimi ve olgunlaşma (Hatten, &#39;99) yol açar ortak bir süreç. Eksitatör ve inhibitör: Serebral korteks, iki temel nöronal türleri oluşur. Bu hücreler, farklı alanlarda ortaya çıkan ve farklı yollar boyunca (Pearlman ve ark. &#39;98) Korteks göç . Inhibitör çoğunlukla ganglion eminences (. Xu ve ark, &#39;04. Gelman ve ark, &#39;09) farklı bölgelerinde, teğet subkortikal kaynaklardan göç. (Hatten, &#39;90; Caviness &amp; Rakic ​​Rakic, &#39;90, &#39;78) Onların hareketi uygun serebral korteksteki hücre mimarisini ve bağlantı kurulması için izin vermek, çevresel ipuçları dayattığı hassas Spatiotemporal kontrolü gerektirir. Ganglion eminences (GE), in vitro yenidoğan ferrets proliferatif bölgelerde üretilen hücrelerin göç davranışlarını incelemek için bir BD Matrigel Matrix 3 boyutlu bir kültür düzenleme kullandı. Kültür kurulum iki GE eksplantlar ve serebral korteks çıkarılır ve eksplantlar (Riddle ve ark, &#39;97 ve ark Hasling, &#39;03) arasında konumlandırılmış floresan lateks Retrobeads IX adsorbe test proteinlerin kaynağıdır oluşuyordu. Kültür 2-3 gün sonra, hücreler, radyal yönde doku terk bir eğilim gösteren eksplant kenarında görünmeye başlar. Canlı görüntüleme, etiketleme veya işaretleme hücrelere gerek kalmadan göçmen desen gözlem izin verdi. Isochronic gelincik korteks elde ayıklamak protein fraksiyonları için maruz kaldığında, GE hücreleri nicel kinetik analiz bireysel hareket eden hücreler tarafından değerlendirilecek gibi farklı davranışlar sergilemiştir.

3D doku kültürü Zaman atlamalı görüntüleme, serebral korteks fraksiyone protein ayıklamak için tepki olarak ganglion eminens kaynaklanan bireysel hücrelerinin göç davranışı eğitim sağlar.

Gangliyonik Eminence Kültürler oluşturuldu Hücre Göçmen Davranış

Hücre göçü, omurgalı merkezi sinir sisteminin gelişimine ve olgunlaşmasına yol açan yaygın bir süreçtir (Hatten, '99). Serebral...

Bu prosedürde, ganglionik eminensden serebral kortekse hücre göçünün, kortikal protein ekstraktının farklı fraksiyonları tarafından nasıl etkilendiğini incelemek için bir in vitro kültür kurulur. İlk olarak, yavaş salınımlı protein kaynakları hazırlamak amacıyla lateks mikroküreler münferit fraksiyonlar ile inkübe edilir. Bir gelincik beyni çıkarılır ve koronal düzlemde kalın dilimler halinde kesilir.Ganglion eminenslerden doku eksplantları punch yöntemiyle çıkarılır. Mikrosferlerin ve hücre dışı matrise gömülmüş eksplantların yer aldığı üç boyutlu kültürler oluşturulur. Bir inkübasyon süresinin ardından, brightfield mikroskobu altında zaman ayarlı görüntü kaydı gerçekleştirilir.Bu tekniğin kemotaktik oda kullanımı gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, tekil hücrelerin hareketlerinin gözlemlenebilmesi ve nicelleştirilebilmesidir. Bu yöntem; kemotaksi ve Kama gibi sinir sisteminin gelişimi alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına ve hareketliliğin kinetik kontrolüne yardımcı olabilir.Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişiler, Matrigel ile küçük doku eksplantlarını işlemenin zorluğu nedeniyle zorlanabilirler. Başlamak için, donmuş Matrigel'i nemli buz üzerinde yavaşça çözdürün; böylece Matrigel çözülürken sıcaklığın, matriksin erken katılaşmasını önleyecek kadar düşük kalması sağlanır. 500 mililitre yapay beyin omurilik sıvısını veya A CSF'yi filtre ederek sterilize edin ve ardından plastik bir flakonu -80 °C dondurucuya yerleştirerek kısmi dondurma (slush freeze) işlemi uygulayın.Çeperlerde ince bir buz tabakası oluştuğunda, erleni sallayarak bu tabakayı kırın, ardından güzel bir bulamaç oluşana kadar başka bir tabaka oluşmasına izin vererek işlemi tekrarlayın. Sonra, üreticinin talimatlarına göre nörobazal ortam hazırlayın ve filtrasyonla sterilize edin. Protein fraksiyonunu, matrigele difüzyon için floresan lateks mikroküreler veya boncuklar üzerine absorbe etmek amacıyla 0,22 µm filtre membranını kullanın ve kullanıma hazır olana kadar 37 °C'de inkübe edin; beş farklı protein fraksiyonunun her birinden 100 ila 200 µL içeren ayrı EOR tüplerine 10 µL boncuk ekleyin.Bir çalkalayıcı üzerinde, oda sıcaklığında, karanlıkta 30 dakika inkübe edin. 30 dakikalık inkübasyonun ardından, pancarları bir masaüstü santrifüj kullanarak maksimum hızda bir saat boyunca çöktürün. Hayvan uol ile derin şekilde anestezi edildikten sonra, tüm beyni diseke ederek çıkarın ve önceden hazırlanmış buz gibi soğuk A CSF içine daldırın.Hemisferleri bir bistüri kullanarak tamamen ayırın ve koronal kesitleri 500 micrometers kalınlığında dilimleyin. Bir doku parçalayıcı veya benzeri bir cihaz kullanarak, dilimleri içinde buz soğukluğunda A CSF bulunan ve ıslak buz üzerinde duran küçük bir Petri kabına toplayın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, gangliyonik eminensleri veya ge içeren dilimleri belirleyin ve sonraki adımları engelleyebilecek korteks bölgelerini budayarak uzaklaştırın.GE'nin ventriküler yüzeyine yakın bölgeye bir Harris unicorn punch ile baskı uygulayın. Ağırlıklı olarak ventriküler zonu içeren bir çekirdek çıkarın ve bunu bir piston yardımıyla buz gibi soğuk nörobazal medyumun içine itin. İmplant grubunu medyumdan alarak ayrı bir kaba yerleştirilmiş 0,5 mL buz gibi soğuk Matrigel damlasına aktarın.Eksplanın tamamen daldırıldığından emin olun ve hava kabarcıklarından kaçının. Kabı, doku kültürü davlumbazı içinde ıslak buz üzerinde tutun. Kültürü hazırlayın.Her kuyucuğun merkezine iki µL soğuk matrigel damlatarak altıncı derece kuyucuklu plakaları derecelendirin. 20 µL'lik bir pipet ucu kullanarak her damlanın üzerine otoklavlanmış yuvarlak 18 mm'lik cam lameli yerleştirin. Süpernatantı uzaklaştırın ve boncukları bir vorteks kullanarak 10 µL nörobazal besiyerinde yeniden süspanse edin veya süspansiyona buzda çözünmüş 30 µL matrigel ekleyin.İyice karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Diseksiyon mikroskobunun yardımıyla, 20 µL'lik bir pipet kullanarak bir ila iki µL boncuk süspansiyonu yerleştirin ve kurumasına izin vermediğinizden emin olarak bir ila iki dakika bekletin. Matrigel damlasından iki adet explan alın ve bunları boncuk birikintisinin istenen yakınlığına yerleştirin.Simetrik olarak ve karşıt yönlerde, sıfır nokta beş ila bir milimetre uzağa nokta koyun. Oda sıcaklığında beş dakikadan fazla olmayacak şekilde bekletelim. Boncukları yaklaşık 30 µL matrigel ile düz bir tabaka halinde kaplayın ve 37 °C'lik doku kültürü inkübatörüne 15 dakika boyunca yerleştirin; inkübasyon sonrası 2 mL neuro basal medium ekleyin ve ardından üç ila dört gün boyunca tekrar inkübatöre yerleştirin.İnkübasyon sonrası göç aktivitesini günlük olarak izleyin ve radyal olarak homojen bir hücre bulutu oluşturmuş implantlara sahip, ilgilendiğiniz lamel camları seçin. Seçilen lamel camları taze bir kültür plağına yerleştirin ve gece boyunca inkübe edin. Görüntüleme öncesinde, lamel camların altındaki mikro kabarcıkları gidermek için doku kültürü kabininde steril bir spatula kullanarak lamel camı hareket ettirin.Kurumayı önlemek için kuyucuklar arasındaki boşlukları suyla doldurun ve plakayı dikkatlice mikroskoba aktarın. Görüntüleme yazılımını kullanarak bir görüntüleme şeması belirleyin. Bir z düzlemi serisi toplayarak kültürün 3D doğasını dikkate aldığınızdan emin olun.Parametreler ayarlandıktan sonra, time-lapse işlemini başlatın. Burada, göç eden hücreler üreten bir ganglion ve eminence explan'ın temsili time-lapse kaydı gösterilmektedir. Hücreler dokudan radyal olarak dışarıya doğru göç eder.Protein kaynağına olan ilgileri, kaynağın doğasına bağlı olarak değişkenlik gösterir. Bu yüksek büyütmeli videoda, hareket eden hücreler tek tek kolayca takip edilebilir. Ok uçlarıyla belirtildiği üzere, birçok hücrenin dallandığı görülmektedir.Bunların birkaçı oklarla belirtilmiştir. Tekil hücrelerin izlenmesi, daha sonra analiz edilebilen konum bilgileri sağlar. Örnek grafikler, explan'dan ayrılan hücrelerin belirgin yörüngeleriyle kanıtlandığı üzere, A ve D fraksiyonları arasında farklı bir yanıt olduğunu göstermektedir. Yöntem kavrandığında.Bu teknik, doğru şekilde uygulandığında dört saat içinde tamamlanabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, mat jelin buz üzerinde tutulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, proteinlerin yavaş salınımlı bir kaynağının nasıl hazırlanacağı, üç boyutlu bir doku kültürü sisteminin nasıl kurulacağı ve tekil hücrelerin hareketlerini gözlemlemek ve analiz etmek için zaman ayarlı görüntülemenin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

migratory-behavior-of-cells-generated-in-ganglionic-eminence-cultures

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu protokolü biz galvanotaksis sırasında nöral prekürsör hücre translokasyon edilen erişkin beyninin time-lapse görüntüleme sağlamak için bir doğru akım elektrik alanın uygulanmasına izin özel odaları oluşturmak nasıl gösterilmektedir.

Dıştan Uygulanan Doğru Akım Elektrik Alanında Nöral Prekürsör Hücre Göç Kinetik Analizi için galvanotaksis Assay

Burada SC'ler uzanan aksonlar boyunca geliştirmek için mümkün olduğu bir Schwann hücresi (SC) göç tahlil tarif.

Büyüyen Aksonlar boyunca murin Schwann Hücresi Kalkınma Analizi

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Hücre kültürü modelleri çevre koşulları üzerinde ayrıntılı kontrol sağlar ve böylece nöronal hücre biyolojisi sayısız yönlerini aydınlatmak için güçlü bir platform sağlar. Biz civciv embriyolardan duyusal nöronlar, izole ayırmak ve kültür bir, hızlı, ucuz ve güvenilir bir yöntem açıklanmaktadır. Katmanlarından hazırlanması ve immunositokimya detayları da sağlanmıştır.

Civciv Embriyolar itibaren İzolasyon ve Disosiye Duyu Nöronlar Kültür

GABAerjik kortikal interneuron atalarıdır nakli sonrası bir konak korteks entegre sinaptik geliştirmek ve dağıtmak. Bu hücreler kolayca genetik olarak modifiye edilmiş GABAerjik ön in vivo çalışmalar için transplantasyonundan önce transduse edilebilir. Burada, biz mevcut Cre hatları ve Kre-bağımlı gazetecilere kullanarak belirli interneuron alt grupları hedef viral etiketleme teknikleri gösteriyor.

Viral-aracılı Etiketleme ve medial Gangliyonik Eminence Transplantasyon (MGE) Hücreler<em&gt; İn Vivo</em&gt; Çalışmalar

Epitelden mezenkimal geçişe (EMT) kanserlerin invaziv hale gelmesine izin verir. EMT'yi araştırmak için, serum ve enzimlerden yoksun bir nöral kök hücre (NSC) tabanlı in vitro model tanımlanmıştır. Bu standartlaştırılmış sistem, hücre göçünün, gen ve protein ekspresyonunun kantitatif ve kalitatif değerlendirmesine izin verir. Model, ilaç keşfi için uygundur.

Ilaç keşfi için uygundur EMT araştırma için enzim ve serum içermeyen nöral kök hücre kültürü modeli

Burada gerçek zamanlı olarak insan glioma hücre (hGC) göç çalışması için eski vivo karışık monolayer kültür sistemi saiyoruz. Bu model, hGC'ler ile hem miyelinli hem de miyeline olmayan aksonlar arasındaki etkileşimleri bölümlere ayrılmış bir oda içinde gözlemleme olanağı sağlar.

Dorsal Kök Ganglion Akson-Oligodendrocyte Co-Kültürler İnsan Glioma Hücre Göç Gerçek Zamanlı İzleme

Biz üç basit in vitro tahliller-uzun mesafe göç tahlil, co-kültür göç tahlil ve kemo-attraction tahlil-topluca insan kök hücre perisiyitli endotel hücreleri ve bunların işlevlerini değerlendirmek GABAerjik internöronlar ile etkileşim.

Göç, Kemo-Attraction, ve Co-Kültür Tahliller İnsan Kök Hücre Kaynaklı Endotel Hücreleri ve GABAerjik Nöronlar için

Chick siliker gangliyonu (CG) parasempatik sinir sisteminin bir parçasıdır. Civciv CG nöronların nöronal kültürlersinir kas etkileşimleri çalışmada etkili hücre modelleri olduğu gösterilmiştir. Biz diseksiyon, dissosilasyon ve civciv embriyolarından CG nöronların in vitro kültür için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Chick Ciliary Ganglion Nöronların İzolasyon ve Kültür

Burada, desenli nöronlar üzerinde glioblastoma (GBM) göçünü analiz etmek için kullanımı kolay bir ortak kültür tahlili sunuyoruz. Nöronlar üzerinde GBM hücre göçünün kolay ölçülmesi için FiJi yazılımında bir makro geliştirdik ve nöronların GBM hücre invaziv kapasitesini değiştirdiğini gözlemledik.

Göç ve Hücresel Etkileşimleri İncelemek İçin Desenli Nöronlarda Glioblastoma Kök Benzeri Hücrelerin Ortak Kültürü

Bu çok yönlü protokol, civciv embriyolarından kraniyal nöral kıvrımların eksizyonu yoluyla göç öncesi nöral krest hücrelerinin (NCC'ler) izolasyonunu tanımlar. Kaplama ve inkübasyon üzerine, göçmen NCC'ler nöral kıvrım eksplantlarından ortaya çıkar ve basitleştirilmiş bir 2D ortamda hücre morfolojisinin ve göçünün değerlendirilmesine izin verir.

Civciv Kraniyal Nöral Kret Hücre Kültürlerinin Hazırlanması ve Morfolojik Analizi

Öğrenin gangliyonik eminans hücrelerinin göç davranışlarını 3D doku kültürleri ve zaman atlamalı görüntüleme ile incelemeyi. Bu yöntem, sinir sistemi gelişimi araştırmalarında bireysel hücre hareketlerini gözlemlemeyi sağlar.

Gangliyonik Eminence Kültürler oluşturuldu Hücre Göçmen Davranış

Daha fazla video keşfet