Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi

Deneyin genel amacı, apoptoz ve/veya nekroz yoluyla hücre ölümünün değerlendirilmesi için geleneksel Ek beş ve Propidium iyodür boyama teknikleriyle ilgili mevcut sorunların üstesinden gelmektir. Çok çeşitli hücre dizilerinin ve birincil hücrelerin geleneksel boyama yaklaşımlarının %40'a kadar yanlış pozitif olaylarla sonuçlandığını bulduk. Bu yanlış pozitif olaylar, sitoplazmik RNA'nın boyanmasından kaynaklanmaktadır.

Tersine, protokolümüz, belirli aşamalarda fiksasyon ve RNA bozunma adımlarını tanıtarak yanlış pozitif vakaların sayısını büyük ölçüde azaltır Boyama prosedüründe, ilk hücreler, geleneksel prosedürlere göre hücre ölümünü tespit etmek için beşte bir X ve peridyum iyodür ile boyanır. Daha sonra hücreler, plazma zarının geçirgenliğini artıran% 1 formaldehit ile sabitlenir. Son olarak, sabit hücreler, sitoplazmik RNA'yı parçalamak için RNA'lar A ile muamele edilir ve propidyum iyodür lekelenmesine neden olan yanlış pozitifliği ortadan kaldırır.

Birçok hücre biyoloğu gibi, apoptotik ve nekrotik hücre ölümünü tespit etmek için konvansiyonel nexin five ve propidium iyodür akış sitometrisi yöntemlerini kullandık. Ne yazık ki, son zamanlarda bu yöntemin bir dizi hücre hattında ve birincil hücrelerde %40'a varan önemli sayıda yanlış pozitif olaya yol açtığını bulduk. Bu güncelleştirilmiş yöntem, bu uyarıların üstesinden gelir.

Yaklaşımımız, cyop Plasmic RNA'yı seçici olarak çıkarmak için prosedür boyunca belirli adımlarda hücre sabitleme ve RNA sindiriminden yararlanır, doğrudan bu yanlış pozitif olaylara yol açan boyama, deney için analiz edilecek hücreleri hasat eder. Bu videoda ham makrofajları kullanıyoruz. Örnek olarak, numuneleri 335 Gs'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve hücreleri iki mililitre bir XPBS'de yeniden askıya alın.

Daha sonra hücreleri aynı koşullar altında tekrar yıkayın. Bu sefer, hücreleri bir mililitre bir X NX ve beş bağlayıcı tampon içinde askıya alan resus. Numuneleri santrifüjledikten ve süpernatanı boşalttıktan sonra, hücreleri bir X NX Xin beş bağlayıcı tamponun 100 mikrolitrelik son hacminde yeniden süspanse edin.

Üreticinin tavsiyelerine göre her hücre örneğine bir Xin beş ekleyin. Örneğin, bu videoda, her bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe 2,5 mikrolitre Xin beş zi ekleniyor. Tüpleri karanlıkta oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin.

Daha sonra her bir reaksiyon tüpüne beş bağlayıcı tamponda 100 mikrolitre bir X NX ekleyin. Şimdi her tüpte yaklaşık 200 mikrolitre çözelti olmalıdır. Daha sonra, bir X NX.In beş bağlayıcı tamponda bir ila 10 seyreltme propidium, iyodür veya PI hazırlayın, her tüpe dört mikrolitre seyreltilmiş PI ekleyin, her numunede mililitre pi başına iki mikrogramlık bir nihai konsantrasyon elde edin.

Tüpleri karanlıkta tekrar oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresinden sonra, hücreleri 500 mikrolitre bir x ve x ve beş bağlayıcı tampon ile yıkayın ve numuneleri 335 Gs'de dört santigrat derecede 10 dakika santrifüjleyin ve snat'ı boşaltın. Hücreleri 500 mikrolitre bir X NX ve 500 mikrolitre% 2 formaldehit içeren beş bağlayıcı tampon içinde yeniden askıya alın.

%1'lik bir formaldehit çözeltisi oluşturmak için tüpleri hafifçe vurarak karıştırın. Numuneleri sabitledikten sonra 10 dakika buz üzerinde sabitleyin. Her numuneye bir mililitre bir XPBS ekleyin ve hücreleri yıkama sırasında üç kez dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 425 Gs'de santrifüjleyerek hafifçe karıştırın.

Bir XPBS'de bir ila 100 seyreltme RNA A hazırlayın, tüpleri hafifçe vurarak peleti yeniden süspanse edin ve mililitre başına 50 mikrogramlık bir nihai konsantrasyon verecek şekilde 16 mikrolitre seyreltilmiş RNA, A çözeltisi ekleyin. Daha sonra numuneleri 37 santigrat derecede 15 dakika inkübe edin. Daha sonra, hücreleri bir mililitre bir XPBS'de yıkayın ve hafifçe vurarak hafifçe karıştırın, ardından tüpleri dört santigrat derecede sekiz dakika boyunca 425 GS'de santrifüjleyin.

Numuneler artık analiz edilmeye hazırdır. Alternatif olarak, N-XM-P-I boyama diğer prosedürlerle paralel olarak gerçekleştiriliyorsa, numuneler sonraki boyama adımları için kullanılabilir. Temsili görüntü akışı akış sitometresi görüntüleri, üç benzersiz hücre popülasyonunda yanlış pozitif boyamanın derecesini gösterir.

Yaygın olarak kullanılan bir hücre hattı ham makrofajları ve kemik iliği makrofajlarını ve akvaryum balığı birincil böbrek makrofajlarını yansıtan iki birincil hücre hattı. Japon balığı birincil makrofajlarının kullanımı, bu tekniğin çeşitli hücresel platformlarda uygulanabilirliğini vurgulamaktadır. Gerçek pozitif olaylar, PI ve drac arasındaki nükleer bölme içinde beklenen kolokalizasyonu gösterir.

Beş, sarı boyama ile kanıtlandığı gibi, canlı ve ölü hücrelerin nükleer bölmesini doğru bir şekilde boyayan oldukça zar geçirgen bir boya. Burada, PI nükleer boyamanın doğruluğu, D dr beş BRDU yedi AA DPI ile benzerlik derecesine göre değerlendirildi ve DRAC beş, ham 2 64 0.7 makrofaj hücre hattındaki çekirdeği doğru bir şekilde boyama yeteneklerinde% 99'dan daha fazla benzerlik sergiledi. Buna karşılık, geleneksel protokoller kullanılırken ortaya çıkan sitoplazmik PI boyaması, d dr beşe göre nükleer boyamanın yüzde benzerliğinde belirgin bir azalmaya yol açtı.

Bu şekilde, mililitre RNA A başına 50 mikrogramın dahil edilmesinin nükleer olmayan PI boyamasını ortadan kaldırdığı ve murn, kemik iliği makrofajı ve akvaryum balığı birincil böbrek makrofaj hücrelerinde d dr beş boyamaya göre benzerlik derecesini önemli ölçüde arttırdığı görülebilir. Bu şekildeki primer böbrek makrofajlarının temsili görüntüleri, RN a tedavisi ile sitoplazmik bölmede RNA boyama kaybını göstermektedir. Primer akvaryum balığı böbrek makrofajlarının bu dağılım grafikleri, modifiye edilmiş nexin PI protokolü ile hazırlanan hücrelerde yalancı apoptotik nekrotik olaylarda önemli bir azalma olduğunu göstermektedir.

Yeni protokol, hücrelerin %84,9'unun canlı olduğunu gösteriyor. Kapılar, floresan ve morfolojik özellikleri değerlendiren paralel görüntü akışı örneklerine dayalı olarak çizildi. Bir örnekte, erken progenitörlerin monositleri ve olgun makrofajlar, bu videoda açıklanan beş PI protokolünde modifiye NX ile boyandı veya bu şekil için geleneksel yöntemle, modifiye protokol tarafından boyanan hücre, RNA'ların tedavisi ile yanlış pozitif olayların giderilmesine bağlı olarak pozitif PI olaylarının sayısında görsel bir azalma gösterdi.

Ayrıca, bu etki büyük olgun makrofaj hücrelerinde daha küçük, erken progenitör hücrelere göre daha belirgindi. Konvansiyonel protokollere dayanan sonuçlar, daha olgun makrofaj alt kümeleri için hücresel ölümde hatalı bir şekilde pozitif bir korelasyon önermiş olabilirdi Bu boyama prosedürünü takiben, hücre izolatınızdaki alt popülasyonlar hakkında belirli soruları yanıtlamak için hücre içi veya yüzey boyama gibi daha ileri adımlar gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin alaka düzeyi, bağışıklık temelli soruların ötesine geçer, örneğin, hücre döngüsü durması ile tedavi edilen genotoksik stres hücrelerine maruz kalan hücreleri, timidin veya hidroksiüre gibi ilaçları ve gelişimsel ilerlemenin hücresel RNA sentezindeki ayrık değişikliklerle karakterize edildiği embriyonik hücreler üzerinde yapılan çalışmaları kullanan deneysel sistemlerle de ilgilidir.