Name: Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 34 s
Description: Öğrenin, hücre ölümünü değerlendirmek için modifiye Annexin V/PI apoptoz testini. Formaldehit fiksasyonu ve RNaz A ile sitoplazmik RNA'yı parçalayarak %40'a varan yanlış pozitif sonuçları ortadan kaldırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışmada, Doğa Bilimleri ve Mühendislik Konseyi, Kanada (NSERC) araştırma bursu ve bir Alberta Tarım DRB Finansman Konsorsiyum hibe tarafından desteklenmiştir. AMR bir NSERC Vanier Kanada Yüksek Lisans Bursu, Alberta asistanlığa bir üniversite ve bir Kraliçe Elizabeth II yüksek lisans bursu ile desteklenmektedir.

Bu prosedür, 500 mcL silikonlu tüpler veya 6 ml polistiren yuvarlak alt FACS tüpler yapılabilmektedir. İkincisi, diğer prosedürleri ile birlikte canlılığını analizi yaparken normal olarak kullanılır. 6 ml polistren yuvarlak alt FACS tüpler için verilen tüm birimleri. 500 mcL silikonlu borular için tüm birimler, 1 / 5 oranında azaltır. Flow sitometri analizi için optimum konsantrasyonu 200 mcL hacim başına 2-4 x 10 6 hücre. Hücre kaybı bu yordamı neden olabilir ve böylece biz her numune prosedürün başlangıcında 4 x 10 6 hücre oluşur. 1. Hücre Hazırlık <ol><li> Hasat hücreleri - karşılık gelen hücre hatları veya birincil hücre izolasyonların için belirli prosedürleri bakın. </li><li> 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün. </li><li> Süspanse edin hücreleri 2 mL 1 x fosfat tamponlu salin (PBS) / - (kalsiyum, magnezyum). </li><li> 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün. </li><li> 1 ml 1 x Annexin V bağlayıcı tampon hücrelerin tekrar </li><li> 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün. </li><li> 100 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon içinde süspanse edin hücreleri. </li></ol> 2. Annexin V / PI Uygulama Leke <ol><li> Üreticinin tavsiyelerine göre Annexin V [örneğin 5 mcL Annexin V Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, A13201)]. </li><li> Karanlık tüpler 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Her reaksiyon tüpüne 1 x Annexin V bağlayıcı tampon 100 mcL ekleyin. Her bir tüp yaklaşık 200 mcL olmamalıdır. </li><li> 1 x Annexin V bağlayıcı tamponu (yani x Annexin V bağlayıcı tampon 9 mcL 1 ile 1 mcL PI) 01:10 seyreltilmiş PI 4 mcL (Sigma, Kedi # P-4864-10ML) ekleyin. Bu, her örnek 2 mcg / ml son bir PI konsantrasyon verecektir. </li><li> Karanlık tüpler 15 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Hücreleri yıkamak için 500 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon ekleyin. </li><li> 10 dakika boyunca 335 x g örnekleri santrifüj ve süpernatantı süzün. </li><li> 500 mcL 1 x Annexin V bağlayıcı tampon ve% 1 formaldehit (fiksatif) çözümü oluşturmak için 500 mcL% 2'lik formaldehit içinde süspanse edin hücreleri. Tüpler nazik hafifçe vurarak karıştırın. </li><li> 10 dakika boyunca buz üzerinde örnekleri sabitleyin. Alternatif olarak, numuneler 4 gecede saklanan ° C karanlıkta. İkinci yöntem seçilirse, Annexin V / PI (tazminat kontrolleri dahil olmak üzere) etiketli tüm tüpler tutarlı emin olun. </li><li> Her bir örnek ve hafifçe vurarak yavaşça karıştırın - / - 1 ml 1 x PBS ekleyin. </li><li> Sekiz dakika için 425 x g tüpler Santrifüj ve süpernatant süzün. </li><li> 2.10 ve 2.11 adımları tekrarlayın. </li><li> Tüp Flicking tarafından süspanse edin pelet. </li><li> 50 mcg / mL son bir konsantrasyon elde etmek 1:100 sulandırılmış RNaz A (Sigma, R4642) 16 mcL ekleyin. 37 az 15 dakika boyunca inkübe ° C. </li><li> / - 1 ml 1 x PBS ekleyin ve hafifçe vurarak yavaşça karıştırın. </li><li> Sekiz dakika için 425 x g tüpler santrifüjleyin. </li><li> Numuneler analiz edilecek hazır. Annexin / PI boyama diğer prosedürleri ile paralel olarak yapılıyorsa Alternatif olarak, numuneler sonraki boyama adımlar için kullanılan olabilir. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar: Hücre tipleri ve hücre hatları, yanlış pozitif PI boyanma değişen derecelerde örnekleri Şekil 1'de gösterilmiştir. (Şekil 2B) RNaz tedavi uğramadı hücrelere göre yanlış pozitif olayların sayısında önemli bir azalma yanlış pozitif olaylar için hesap için, hücreler fikse edildi ve daha sonra bu sonuçlar RNaz A. ile tedavi. Şekil 2C hiçbir RNaz tedavisi görmüş hücrelere kıyasla RNaz tedavi uygulandı hücreleri temsil eden görüntüler gösterir. Şekil 3 fiksasyon ve RNaz tedavi adımları ile modifiye Annexin V / PI protokolü, yanlış pozitif boyanma olayların sayısının sınırlandırılması geleneksel protokoller üzerinde nasıl geliştirdiğini gösteriyor. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Konvansiyonel propidium iyodür boyama protokolleri önemli sayıda yanlış pozitif olayların yol açar. Daha önce, hayvan modellerinin çok geniş bir yelpazeden yanı sıra çeşitli hücre hatları 10 birincil hücreler boyunca yanlış pozitif boyanma yaygınlığı değerlendirilir . Temsilcisi görüntüleri üç benzersiz hücre popülasyonları (RAW makrofaj ve iki birincil hücreler fare kemik iliği makrofajlar (BMM) ve Japon balığı primer böbrek makrofajlar (PKM) yaygın olarak kullanılan hücre hattı) yanlış pozitif boyanma ölçüde göstermektedir. Gerçek pozitif olayların nükleer bölmesi içinde beklenen PI ve DRAQ5 arasındaki ortak lokalizasyonu (PI ve DRAQ5 sarı alanlar arasında ko tasvir) gösterir. DRAQ5 yüksek membrane geçirgen boya, canlı ve ölü hücreleri 10,11,12 hem doğru lekeleri nükleer bölmesi. Ko DRAQ5 daha kolay görsel tespiti için leke yeşil pseudocolour verildi. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. PI nükleer boyanma doğruluğunu artırma. (A) DRAQ5 için iyi karakterize nükleer lekeleri çok sayıda (BrdU, 7-AAD ve DAPI) benzerlik derecesine göre PI nükleer boyanma doğruluğu değerlendirildi. BrdU hızla çoğalan hücrelerin DNA içine dahil olup, sadece nükleer bölmesi gibi içinde leke sentetik bir nükleozid. 7-AAD, sağlam bir plazma zarı geçemez, PI benzer bir DNA yüksek afinite ve vardır. DAPI DNA için de güçlü bir ilgisi vardır ve en yaygın olarak kullanılan nükleer floresan mikroskopi leke. Doğru RAW 264,7 makrofaj hücre çekirdeğinde leke yeteneğini vurgulayarak, BrdU, 7-AAD, DAPI ve DRAQ5 arasında benzerlik derecesi&gt;% 99 oldu. Buna karşılık, geleneksel protokoller dayalı sitoplazmik PI boyama DRAQ5 için göreli boyama yüzde benzerlik belirgin bir azalmaya yol açar. Fare kemik iliği makrofajlar (BMM) ve Japon balığı primer böbrek makrofajlar (PKM): (B) Benzer sonuçlar test iki birincil hücreler gözlenir. 50 mcg / ml RNaz A boyama prosedürü içinde belirli bir aşamada dahil edilmesi, nükleer olmayan PI boyama kaldırır ve DRAQ5 boyama göre benzerlik derecesi önemli ölçüde artırır. (C) primer böbrek makrofajlar Temsilcisi görüntüleri ve RNaz tedavi olmadan hücrelerin ölçüde benzerlik göstermektedir. Tedaviler arasında farklılıklar daha kolay görsel tespiti için, DRAQ5 yeşil verildi. Sarı alanlar arasında ko BrdU ve DRAQ5 ve PI ve DRAQ5 betimliyor. <img src="/files/ftp_upload/2597/2597fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Modifiye Annexin V / PI yanlış apoptozis / nekrotik olaylar önemli ölçüde azaltır. İlköğretim goldfish böbrek makrofajlar (PKM), geleneksel ve modifiye Annexin V / PI protokolleri ile boyandı. Saçılım Annexin V / PI goldfish PKM leke betimliyor. Soldaki saçılım PKM hücrelerinin geleneksel Annexin V / PI boyama (RNaz yok) gösterir. Sağda saçılım modifiye Annexin V / PI protokolü (RNaz) ile boyandı PKM hücreleri gösterir. Ayrıca yanlış pozitif lekeleri kaldırılması nedeniyle PI boyama belirgin bir azalma RNaz sonuçları. PKM hücreler daha sonra farklı kültürlerin erken atalarıdır içinde nüfus (AP), monositler (Mono) ve olgun makrofajlar (Mat mac) dayalı analiz edildi. Yanlış pozitif olayların kaldırılması nedeniyle, olumlu PI olayların sayısında azalma, küçük erken progenitör hücreleri daha büyük olgun makrofaj hücreleri daha belirgindir. Geleneksel protokollerine dayalı sonuçlar hatalı hücre ölüme daha olgun makrofaj altkümelerini için pozitif bir korelasyon önerilen olurdu.

<ol><li>Vermes, I., Haanen, C., Steffens-Nakken, H., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+assay+for+apoptosis.+Flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+early+apoptotic+cells+using+fluorescein+labeled+Annexin+V%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A novel assay for apoptosis. Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V.</a> J Immunol Methods. 184, 39-51 (1995).</li>
<li>Vermes, I., Haanen, C., Reutelingsperger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+of+apoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry of apoptotic cell death.</a> J Immunol Methods. 243, 167-190 (2000).</li>
<li>Cornelissen, M., Philippe, J., De Sitter, S., De Ridder, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+expression+in+apoptotic+peripheral+blood+lymphocytes%3A+An+electron+microscopic+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Apoptosis%22%5BJournal%5D)">Annexin V expression in apoptotic peripheral blood lymphocytes: An electron microscopic evaluation.</a> Apoptosis. 7, 41-47 (2002).</li>
<li>Fried, J., Perez, A. G., Clarkson, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytofluorometric+analysis+of+cell+cycle+distributions+using+propidium+iodide.+Properties+of+the+method+and+mathematical+analysis+of+the+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow cytofluorometric analysis of cell cycle distributions using propidium iodide. Properties of the method and mathematical analysis of the data.</a> J Cell Biol. 71, 172-181 (1976).</li>
<li>Bacso, Z., Everson, R. B., Eliason, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+DNA+of+Annexin+V-binding+apoptotic+cells+is+highly+fragmented%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The DNA of Annexin V-binding apoptotic cells is highly fragmented.</a> Cancer Res. 60, 4623-4628 (2000).</li>
<li>Darzynkiewicz, Z., Bruno, S., Del Bino, G., Gorczyca, W., Hotz, M. A., Lassota, P., Traganos, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+of+apoptotic+cells+measured+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Features of apoptotic cells measured by flow cytometry.</a> Cytometry. 13, 795-808 (1992).</li>
<li>Kroemer, G., Dallaporta, B., Resche-Rigon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+death%2Flife+regulator+in+apoptosis+and+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial death/life regulator in apoptosis and necrosis.</a> Annu. Rev. Physiol. 60, 619-642 (1998).</li>
<li>Denecker, G., Vercammen, D., Declercq, W., Vandenabeele, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+and+necrotic+cell+death+induced+by+death+domain+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Apoptotic and necrotic cell death induced by death domain receptors.</a> Cell Mol. Life Sci. 58, 356-370 (2001).</li>
<li>Faleiro, L., Lazebnik, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caspases+disrupt+the+nuclear-cytoplasmic+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caspases disrupt the nuclear-cytoplasmic barrier.</a> J Cell Biol. 151, 951-959 (2000).</li>
<li>Rieger, A. M., Hall, B. E., Luong, L. T., Schang, L. M., Barreda, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conventional+apoptosis+assays+using+propidium+iodide+generate+a+significant+number+of+false+positives+that+prevent+accurate+assessment+of+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Conventional apoptosis assays using propidium iodide generate a significant number of false positives that prevent accurate assessment of cell death.</a> J Immunol Methods. 358, 81-92 (2010).</li>
<li>Edward, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Minireview%3A+Use+of+DNA-specific+anthraquinone+dyes+to+directly+reveal+cytoplasmic+and+nuclear+boundaries+in+live+and+fixed+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cells%22%5BJournal%5D)">Minireview: Use of DNA-specific anthraquinone dyes to directly reveal cytoplasmic and nuclear boundaries in live and fixed cells.</a> Mol. Cells. 27, 391-396 (2009).</li>
<li>Njoh, K. L., Patterson, L. H., Zloh, M., Wiltshire, M., Fisher, J., Chappell, S., Ameer-Beg, S., Bai, Y., Matthews, D., Errington, R. J., Smith, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral+analysis+of+the+DNA+targeting+bisalkylaminoanthraquinone+DRAQ5+in+intact+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Spectral analysis of the DNA targeting bisalkylaminoanthraquinone DRAQ5 in intact living cells.</a> Cytometry Part A. 69, 805-814 (2006).</li>
</ol>

Annexin V / PI protokolü burada sunulan geleneksel protokollerin değiştirilmiş bir sürümü ve PI için yüksek afinite sitoplazma RNA varlığı dikkate alır. Nükleer PI boyama boyama işlemi geç% 1 formaldehit fiksasyonu adım aşağıdaki RNaz A (50 mcg / ml) Giriş hassasiyeti önemli ölçüde artırır. Nükleer PI boyama veya plazma zarı Annexin V boyama olumsuz etkileri görülmektedir. RNaz bir tedaviye gerek kalmadan, PI leke sonuçlarının% 40 kadar downstream sonuçlar 10 bir potansiyel olarak anlamlı ve negatif bir etkiye yol açan yanlış pozitif olaylar, yol açabilir. Modifiye Annexin V / PI boyama protokol basit ve hücre tipleri (İlköğretim hücreleri geniş bir yelpazede etkili bir şekilde kullanılır olmuştur: fare kemik iliği makrofaj ve dalak, domuz akciğer ikamet hücreleri, akciğer alveolar makrofajlar, mezenterik lenf nodu izolatları, periferik kan lökosit splenositlerin; tavuk blastodermin hücreler; goldfish birincil böbrek makrofajlar; sazan periferik kan lökosit, Hücre hatları: RAW 264,7 makrofajlar, Jurkat T hücreleri, domuz 3D4/31 makrofajlar, CCL-71 Japon balığı yüzgeci fibroblastlar, 3B11 kedibalığı B hücreleri 10). Hücreler farklı birincil hücreler genellikle yanlış pozitif olaylar (10) daha fazla sayıda olan yalancı pozitif PI boyama, etkilenen dikkat etmek önemlidir. Bu hücresel popülasyonlar arasındaki farklılıklar, yanlış pozitif PI boyama kısmen hücre boyutunda farklılıklar olabilir, ancak RNA içerik farklılıkları da neden olabilir. Bu yordamı, birleşme deneysel sistemler diğerleri arasında kullanmak, genotoksik stres geçiren hücreler, hücre döngüsü tutuklanması gibi timidin ya da hidroksiüre gibi ilaçlar, viral-enfekte olmuş hücreleri ve gelişim ilerlemesi embriyonik hücreler üzerinde çalışmaları ile tedavi edilen hücreler için özellikle ilgili olarak hücresel RNA sentezi ayrık değişiklikler ile karakterizedir.

<table><tbody><tr><td>1 x PBS-/-</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 x Annexin V Bağlama Tamponu</td><td>BD Biosciences</td><td>556454</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V-Alexa Fluor 488</td><td>Moleküler Problar, Life Technologies</td><td>A13201</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum iyodür (PI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4864</td><td>H içinde 1 mg/mL&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>%2 Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F1268</td><td></td></tr><tr><td>Sığır pankreasından elde edilen RNaz A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R4642</td><td></td></tr><tr><td>DRAQ5</td><td>Biyostatü</td><td>DR50050</td><td>1 x PBS içinde 1:60 oranında seyreltin</td></tr></tbody></table>

hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye annexin v / propidium İyodür apoptoz testi

Modified Annexin V/Propidium Iodide Apoptosis Assay For Accurate Assessment of Cell Death

Hücresel apoptozis Çalışmaları flow sitometri tabanlı yöntemler sunulmasından bu yana önemli ölçüde etkilendi. Propidium iyodür (PI) hücreler, plazma zarı bütünlüğü ve geçirgenliği 1,2 farklılıklar üzerinden, canlı, apoptotik veya nekrotik eğer belirlemek için yaygın Annexin V ile birlikte kullanılır. Annexin V / PI protokolü apoptotik hücre 3 çalışmak için yaygın olarak kullanılan bir yaklaşımdır. Hücreleri 4,5 yaşayan boya hariç kapasitesini dayalı, ekonomik, istikrarlı ve hücre canlılığı iyi bir göstergedir, çünkü PI diğer nükleer lekeleri göre daha sık kullanılır. Bir hücreye girmek için PI yeteneği membran geçirgenliği bağlıdır; PI, sağlam bir plazma zarı 1,2,6 varlığı nedeniyle canlı ya da erken apoptotik hücre leke yapmaz . Geç apoptotik ve nekrotik hücreler, plazma ve nükleer membran bütünlüğünü sağlayarak, PI, membranlar yoluyla geçmesi, nükleik asitler içine enterkale ve kırmızı floresan 1,2,9 gösterilecek 7,8 azalır . Ne yazık ki, bu geleneksel Annexin V / PI protokollerini 10 sitoplazmik bölmesi içinde RNA PI boyama ile ilgili önemli sayıda yanlış pozitif olaylar (% 40), yol bulabilirsiniz. Gösteren yüksek oluşumu 10: (sitoplazmik oranları &lt;0.5 nükleer) Birincil hücre ve hayvan modellerinde geniş bir yelpazede büyük hücreler ile hücre hatları etkilenir. Burada, geleneksel yöntemlere kıyasla hücre ölümü değerlendirilmesi için önemli bir gelişme sağlayan bir değiştirilmiş Annexin V / PI yöntemi göstermektedir. Bu protokol RNaz, boyama aşağıdaki hücre içine girişini teşvik etmek için hücre sabitleme sırasında hücresel geçirgenlik değişikliklerin yararlanır. Zamanlama ve RNaz konsantrasyonu her ikisi de bir sitoplazmik RNA kaldırılması için optimize edilmiştir. Sonuç olarak geleneksel Annexin V / PI protokolleri (sitoplazmik PI boyama &lt;% 5 olaylar) üzerinde önemli bir gelişmedir.

Hücre ölümü değerlendirilmesi için doğru bir yöntem açıklanmıştır. Protokol birincil hücre hücre hatları ve geniş bir yelpazede hayvan modellerinde% 40 yalancı pozitif olaylar kadar ekran geleneksel Annexin V / propidium iyodür (PI) protokolleri, üzerine geliştirir.

Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi

Hücresel apoptoz çalışmaları, akış sitometrisi tabanlı yöntemlerinle birlikte önemli ölçüde etkilenmiştir. Propidyum iyodür (PI) yaygın olarak...

Deneyin genel amacı, hücre ölümünün apoptoz ve/veya nekroz yoluyla değerlendirilmesi için kullanılan geleneksel Aneksin beş ve Propidium iyodür boyama tekniklerindeki mevcut sorunların üstesinden gelmektir. Geniş bir hücre hattı ve primer hücre yelpazesine uygulanan geleneksel boyama yaklaşımlarının %40'a varan oranda yalancı pozitif sonuçlara yol açtığını saptadık. Bu yalancı pozitif olaylar, sitoplazmik RNA'nın boyanmasından kaynaklanmaktadır.Aksine, protokolümüz, boyama prosedürünün belirli aşamalarına fiksasyon ve RNA degradasyon adımlarını ekleyerek yanlış pozitif vakalarının sayısını önemli ölçüde azaltır. Boyama prosedüründe, öncelikle hücreler, konvansiyonel prosedürlere uygun olarak hücre ölümünü tespit etmek için X in five ve propidyum iyodür ile boyanır. Ardından hücreler, plazma membranının geçirgenliğini artıran %1 formaldehit ile fikse edilir. Son olarak, sitoplazmik RNA'yı degrade etmek ve yanlış pozitife neden olan propidyum iyodür boyamasını ortadan kaldırmak amacıyla fikse edilmiş hücreler RNase A ile işleme tabi tutulur.Birçok hücre biyoloğu gibi biz de apoptotik ve nekrotik hücre ölümünü tespit etmek için geleneksel neksin beş ve propidyum iyodür akış sitometrisi yöntemlerini kullandık. Maalesef, son zamanlarda bu yöntemin çeşitli hücre hatlarında ve primer hücrelerde %40'a varan önemli miktarda yanlış pozitif olaya yol açtığını saptadık. Güncellenmiş olan bu yöntem, söz konusu kısıtlamaları ortadan kaldırmaktadır.Yaklaşımımız, bu yanlış pozitif olaylara doğrudan yol açan sitoplazmik RNA'yı seçici olarak uzaklaştırmak için prosedür boyunca belirli adımlarda hücre sabitleme ve RNA sindiriminden yararlanmaktadır. Deney için analiz edilecek hücreleri toplayın. Bu videoda, ham makrofajlar kullanıyoruz. Örnek olarak, numuneleri 4 °C'de 10 dakika boyunca 335 Gs'de santrifüjleyin, süpernatantı boşaltın ve hücreleri 2 mL 1X PBS içinde yeniden süspande edin.Ardından hücreleri aynı koşullar altında tekrar yıkayın. Bu kez hücreleri bir mililitre 1X NX ve 5 bağlama tamponunda yeniden süspande edin. Örnekleri santrifüjleyip süpernatanı dekante ettikten sonra, hücreleri 100 µL 1X NX Xin 5 bağlama tamponundan oluşan nihai bir hacimde tekrar süspande edin.Üreticinin önerilerine göre her hücre örneğine Xin five ekleyin. Örneğin, bu videoda her bir polistiren yuvarlak tabanlı tüpe 2,5 µL Xin five zi eklenmektedir. Tüpleri oda sıcaklığında, karanlıkta 15 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, her bir reaksiyon tüpüne 100 µL 1X NX in five bağlama tamponu ekleyin. Şu an her tüpte yaklaşık 200 µL çözelti olmalıdır. Daha sonra, 1X NX in five bağlama tamponu içerisinde propidyum iyodür veya PI'nin 1/10'luk dilüsynunu hazırlayın. Her tüpe 4 µL dilüe edilmiş PI ekleyerek, her örnekte 2 µg/mL nihai PI konsantrasyonu elde edin.Tüpleri oda sıcaklığında, karanlıkta tekrar 15 dakika inkübe edin. Bu inkübasyon süresinin ardından hücreleri 500 µL 1X NX-5 bağlama tamponu ile yıkayın; örnekleri 4 °C'de 335 G'de 10 dakika santrifüjleyin ve süpernatantı dökün. Hücreleri, başka bir 500 µL 1X NX-5 bağlama tamponu ile 500 µL %2 formaldehit içerisinde yeniden süspande edin.%1'lik formaldehit çözeltisi hazırlamak için tüpleri hafifçe vurarak karıştırın. Sabitleme işleminden sonra numuneleri buz üzerinde 10 dakika boyunca sabitleyin. Her numuneye bir mililitre 1X PBS ekleyin ve hafifçe vurarak karıştırın; yıkama işlemi sırasında hücreleri 4 °C'de sekiz dakika boyunca 425 Gs'de üç kez santrifüjleyin.1X PBS içerisinde RNA A'nın 1/100'lük seyreltisini hazırlayın, tüpleri hafifçe vurarak pelletini yeniden süspande edin ve nihai konsantrasyon 50 µg/mL olacak şekilde seyreltilmiş RNA A çözeltisinden 16 µL ekleyin. Ardından örnekleri 37 °C'de 15 dakika inkübe edin. Sonra hücreleri 1 mL 1X PBS ile yıkayın ve tüpleri hafifçe vurarak nazikçe karıştırın, ardından tüpleri 4 °C'de 8 dakika boyunca 425 ×g'de santrifüjleyin.Numuneler artık analiz edilmeye hazırdır. Alternatif olarak, N-X-M-P-I boyaması diğer prosedürlerle paralel olarak gerçekleştiriliyorsa, numuneler sonraki boyama basamakları için kullanılabilir. Temsili akış sitometre görüntü serileri, üç farklı hücre popülasyonundaki yanlış pozitif boyama düzeyini göstermektedir.Yaygın olarak kullanılan ham makrofaj hücre hattı ile kemik iliği makrofajlarını ve japon balığı primer böbrek makrofajlarını yansıtan iki primer hücre hattı. Japon balığı primer makrofajlarının kullanımı, bu tekniğin çeşitli hücresel platformlardaki uygulanabilirliğini vurgulamaktadır. Gerçek pozitif olaylar, nükleer kompartman içerisinde PI ve drac arasında beklenen kolokalizasyonu göstermektedir.Sarı boyanma ile kanıtlandığı üzere, yaşayan ve ölü hücrelerin çekirdek kompartmanını doğru şekilde boyayan, membran geçirgenliği yüksek bir boya olan Five. Burada, PI çekirdek boyamasının doğruluğu, D dr five BRDU seven A.A D DPI ve DRAC five ile olan benzerlik derecesine göre değerlendirilmiştir; raw 2 64 0.7 makrofaj hücre hattında çekirdeği doğru boyama yetenekleri bakımından %99'dan fazla benzerlik göstermişlerdir. Buna karşılık, geleneksel protokoller kullanıldığında ortaya çıkan sitoplazmik PI boyaması, d dr five'a kıyasla çekirdek boyamasının yüzde benzerliğinde belirgin bir azalmaya yol açmıştır.Bu şekilde, mililitre başına 50 mikrogram RNase A eklenmesinin nükleer olmayan PI boyamasını giderdiği ve murn, kemik iliği makrofajı ve Japon balığı primer böbrek makrofaj hücrelerinde d dr beş boyamasına göre benzerlik derecesini önemli ölçüde artırdığı görülebilir. Bu şekildeki primer böbrek makrofajlarının temsilci görüntüleri, RNase A tedavisi ile sitoplazmik bölmedeki RNA boyamasının kaybolduğunu göstermektedir. Primer Japon balığı böbrek makrofajlarına ait bu dağılım grafikleri, modifiye nexin PI protokolü ile hazırlanan hücrelerde yanlış apoptotik nekrotik olayların önemli ölçüde azaldığını göstermektedir.Yeni protokol, hücrelerin %84,9'unun canlı olduğunu göstermektedir. Kapılar, floresan ve morfolojik özellikleri değerlendiren paralel görüntü akışı örneklerine göre belirlenmiştir. Bir örnekte, erken progenitor monositler ve olgun makrofajlar bu videoda açıklanan modifiye NX in five PI protokolü ile veya bu şekil için konvansiyonel yöntemle boyanmıştır; modifiye protokol ile boyanan hücreler, RNase işlemi ile yalancı pozitif olayların ortadan kaldırılması nedeniyle pozitif PI olaylarının sayısında görsel bir azalma sergilemiştir.Ayrıca, bu etki büyük olgun makrofaj hücrelerinde, daha küçük erken progenitör hücrelere göre daha belirgindi. Geleneksel protokollere dayalı sonuçlar, daha olgun makrofaj alt kümelerinde hücre ölümü için hatalı bir şekilde pozitif bir korelasyon olduğunu öne sürecekti. Bu boyama prosedürünün ardından, hücre izolatınızdaki alt popülasyonlarla ilgili spesifik soruları yanıtlamak için hücre içi veya yüzey boyama gibi ek adımlar gerçekleştirilebilir. Bu tekniğin önemi, immünite tabanlı soruların ötesine geçer; örneğin, genotoksik strese maruz kalan hücreleri kullanan deneysel sistemler, hücre döngüsü durdurucu ilaçlarla (timidin veya hidroksiüre gibi) işlem görmüş hücreler ve gelişimsel ilerleyişin hücresel RNA sentezindeki belirgin değişikliklerle karakterize edildiği embriyonik hücre çalışmaları için de geçerlidir.

modified-annexin-vpropidium-iodide-apoptosis-assay-for-accurate

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Solunum ve oksidatif fosforilasyon ile ve hücre canlılığı üzerindeki ilişkili mitokondriyal fonksiyonları üzerinde, protein kinaz C (PKC), izozimlerinin aktivasyon etkisi tarif edilmektedir. Yaklaşım seçici olarak mitokondriyal işlev ve hücre enerji durumunu belirlemek için birincil hücre kültürü deneyleri ve çeşitli PKC izozimleri overexpress için adenoviral teknik uyum sağlar.

Böbrek Hücreleri aşırı eksprese eden protein kinaz C izozimlerinin Mitokondriyal Fonksiyonlar ve Hücre Canlılık Değerlendirilmesi

Bu videoda, floresan Annexin V boyama kullanarak eritoz, eritrosit programlanmış hücre ölümü derecesini ölçmek için Annexin V bağlanma testini gösteriyoruz. Apoptotik eritrositler, hücre zarının iç kısmından dış broşürüne fosfatidilserin translokasyonu gösterir ve florofor etiketli Annexin V'nin translokasyonlu fosfatidilserine bağlanmasına ve böylece bir floresan sinyali yaymasına neden olur.

Ek V Bağlanma Testi: Fosfatidilserin Etiketleme Yoluyla Apoptotik Eritrositleri Tanımlamak için Floresan Bazlı Bir Teknik

Terapötik bileşikler genellikle ilk canlılığı deneyleri ile in vitro incelenmiştir. Bir insan gözlemci tarafından kör hücre sayımları hücre sayısındaki küçük değişikliklere son derece hassas olabilir ama fonksiyonunu değerlendirmek yok. Bilgisayarlı canlılığı deneyleri, burada açıklandığı gibi, objektif bir şekilde yapı ve fonksiyon hem de değerlendirebilir.

Kültür hücreleri için Canlılık Tahliller

Multiplex deneyleri temel hücresel mekanizmaların için yararlı bilgi sağlamak ve reaktifler ve gereksiz tekrarlı deneyler atık ortadan kaldırabilir. Biz, palmitik asit ile oksidatif karşılaştırmadan sonra, bir in vitro modelde hipotalamik hücre yaşayabilirliğini belirlemek için, flüoresan ve ışıldayan dayalı yöntemler kullanılarak, burada çok katlı bir kaspaz-3/7 aktivite deneyi tarif eder.

Bir Hipotalamik Hücre Modeli Apoptosisi Belirleyen Bir Kaspaz Çoğullama Testi Kullanımı

Anastaz terimi, ölmekte olan hücrelerin geç bir aşamada hücre intihar sürecini tersine çevirdiği, kendilerini onardığı ve nihayetinde hayatta kaldığı fenomeni ifade eder. Burada, anastaz geçiren hücreleri tespit etmek ve izlemek için protokoller gösteriyoruz.

Takip inişi, Apoptosisi tersine Cep Survival Fenomeni için Stratejiler

Akış Sitometresi veya diferansiyel Santrifüjü kullanarak bir iş akışı tespit etmek, ölçmek ve apoptotik vücutlarından apoptotik örneği yüksek saflıkta yalıtmak için geliştirilmiştir.

Algılama ve yalıtım için yüksek saflıkta apoptotik organlarının

Protokol, hücresel canlılığı verimli bir şekilde belirlemek için hızlı, yüksek verimli, güvenilir, ucuz ve tarafsız bir testi tanımlar. Bu tahlil özellikle hücrelerin mitokondrisi hasar gördüğünde yararlıdır, bu da diğer tahlilleri bozar. Hoechst 33342 ve propidium iyodür - Tsay iki nükleer boya ile boyanmış hücrelerin otomatik sayma kullanır.

Mitokan Sitotoksisitesinin Doğru Tayini için Otomatik Diferansiyel Nükleer Boyama Denemesi

Apoptoz, erken ve geç apoptotik biyobelirteçlerin akış sitometrik analizi ile karakterize edilebilir. Serviks kanseri hücre hattı SiHa, bir tezgah üstü akış sitometresi kullanılarak Actinomycin D ile tedaviden sonra apoptoz biyobelirteçleri için analiz edildi.

Aktinomisin D ile Tedavi Edilen SiHa Serviks Kanseri Hücrelerinde Apoptotik Biyobelirteçlerin Akış Sitometrik Analizi

Bu protokol, PMA ile farklılaşmış THP-1 makrofajlarının LPS ve ATP'ye bağlı ölümüne dayanmaktadır. Hücre ölümünü tespit etmek için Annexin V ve 7-AAD çift boyamayı analiz etmek için akış sitometrisi kullanıyoruz, tüm hücreyi kullanıyoruz ve hücre zarı morfolojisini gözlemlemek için taramalı elektron mikroskobu kullanıyoruz.

PMA ile Farklılaşmış THP-1 Makrofajlarının LPS ve ATP ile İndüklenen Ölümü ve Validasyonu

Pyrosequencing (R) polimorfizmleri analiz için kullanılan, bugüne kadarki en kapsamlı ama basit yöntemlerle biridir. Bu yöntem, birçok klinik olarak ilgili polimorfizmleri dahil olmak üzere, hızlı ve verimli bir tek nükleotid polimorfizmi değerlendirme yol açmıştır. Pyrosequencing tekniği ve metodoloji açıklanmıştır.

Pyrosequencing: Doğru Genotiplendirme için Basit Bir Yöntem

Öğrenin, hücre ölümünü değerlendirmek için modifiye Annexin V/PI apoptoz testini. Formaldehit fiksasyonu ve RNaz A ile sitoplazmik RNA'yı parçalayarak %40'a varan yanlış pozitif sonuçları ortadan kaldırır.

Hücre Ölümü doğru değerlendirilmesi için modifiye Annexin V / Propidium İyodür Apoptoz Testi

Daha fazla video keşfet