Name: Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-06-14T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Öğrenin, pulsatif biyoreaktör kullanarak biyolojik temelli vasküler greftlerin nasıl mühendislikle üretildiğini. Bu yöntem, koroner arter hastalığı tedavisinde küçük çaplı damar greftleri oluşturmak için umut vadediyor.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma (LEN hem de) Ulusal Sağlık Hibe R01 EB-008.836 Enstitüleri ve R01 HL083895 tarafından finanse edilmektedir. Biz araştırma biyoreaktörler yapmak için Daryl Smith Üniversitesi cam üfleme, teşekkür etmek ister.

Otoklav Akış sistemi ve Şekil 1 ve Şekil 2'de anlatıldığı gibi biyoreaktör bileşenleri (biyoreaktör kendisi ve silikon tıpa kapağını) için tüp birleştirin ve otoklav. Tüple beslenme, bir ucunda erkek konnektör ve diğer tarafı açık bir sonu vardır. Üç kısa boru parçaları, gaz değişimi için bir silikon kap ile eklenir. 1. Dikiş PGA Mesh <ol><li> Kes PGA örgü 1.1cm x ~ 8cm sayfası (biyoreaktör boyutuna bağlı olarak). </li><li> Distile su (dH20) ve kullanmadan önce kuru hava ile temizleyiniz silikon tüp (3mm iç çapı). </li><li> Dexon 6.0, tek dikiş takip üç cerrahi knot ile başlayan temiz silikon tüp etrafında PGA örgü dikmek için dikiş kullanın. </li></ol> 2. PGA Yüzey Tedavi Yapı iskeleleri <ol><li> 1-2min ve tedavi süresi kayıt ve tüm PGA iskeleleri için aynı anda kullanmak için PGA iskele 1M NaOH batırın. </li><li> PGA iskeleler için dH2O banyolarında 2 dakika 3 kez durulayın. </li><li> Pat PGA dH 2 O banyolarında her dalış arasında Kimwipes kuru iskele. </li><li> Kuru PGA doku kültürü kaputu altında iskeleler üzerinde üfleyici ile 15 dakika süreyle kurumaya. </li></ol> 3. Dikiş Dacron silah <ol><li> Dacron manşet (1 cm), 2-3mm lik bir çakışma ile PGA örgü her ucuna küçük parçalara dikmek Prolen 4.0 sütür kullanın. Not: dikkatli olun ponksiyon silikon tüp (Şekil 3). </li><li> Dacron manşet serbest ucunu etrafında üç dikiş dikmek için aynı sütür kullanın. Adım 5.1 (Şekil 3), Prolen dikiş serbest ucunda yeterli sütür bıraktığınızdan emin olun. </li></ol> 4. Biyoreaktör Meclisi (biyoreaktör kültürü başlamadan önce Gün) <ol><li> % 70 etanol banyo dikili örgü ve silikon tüp, cerrahi aletler, ve ince bir tel, 20-30 dakika bekletin. </li><li> Montaj öncesinde en az 30 dakika boyunca% 70 etanol banyo biyoreaktör ve bu batığın bulunduğu otoklav torbalar açın. Biyoreaktör etanol ile iyice yıkayın emin olun. % 70 etanol tüm biyoreaktör bileşenleri Pozlama ek sterilizasyon adımdır. Bu adım aynı zamanda otoklavlayarak kaldırılır ve vasküler hücreleri için zararlı değildir endotoksin kaldırır. </li><li> Silikon tüp üzerine çekmek için ince tel kullanarak yan kolları ile çekin. </li><li> (Etanol içinde batık örgü tutmak) etanol banyo biyoreaktör alın. Biyoreaktör içinde PGA iskele sıkma ve Prolen sütür (Şekil 3) bağlama alevlendi cam dudakları üzerinden Dacron manşet bağlayarak sabitleyin. </li><li> Biyoreaktör yan kolların bir tarafı silikon tüp konnektörler aracılığıyla bağlayın. </li><li> Yeterli gerilim ile çekin ve silikon tüp diğer tarafında kalan iki konnektörleri silikon tüp içine yerleştirin. Silikon tüp konnektörleri takarken sıkı tutunun! </li><li> Yeniden takın, etanol banyosu içine biyoreaktör ve yan kollar yavaşça konnektörler çekerek etanol ile yıkayın. </li><li> Biyoreaktör ters çevirin ve 10 dakika bekletin. </li><li> Çevir biyoreaktör sağ tarafında yukarı ve ek bir 10 dakika bekletin. </li><li> Tüm etanol boşaltın. </li><li> Fazla etanol tüplerin ucundan damladı tutmak için merkezi çanak serisi ve yer biyoreaktör üç büyük petri kaplarına (10 cm) ayarlayın. </li><li> Biyoreaktör ve PGA mesh 5ml veya 10ml pipet kullanarak doku kültürü su ile yıkayın. Ayrıca silikon tüp içine gömme doku kültürü su. </li><li> Petri kutularının içine iyice biyoreaktör her iki tarafında tüm fazla suyu boşaltın. </li><li> Kuru biyoreaktör blower ve UV OFF kaput geceleme. </li><li> Ek Notlar: steril heyecan bar biyoreaktör olduğundan emin olun. Bu noktadan biyoreaktör üzerinde "vurgulu" için kontaminasyonu önlemek için emin olun. Bol parafilm şeritler kesin ve onları küçük bir% 70 etanol banyo (büyük petri iyi çalışıyor) emmek. </li></ol> 5. 1. Gün: Biyoreaktör Kurulum <ol><li> Kirleticiler PGA iskele içinde korumak amacıyla her biyoreaktör açılması üzerine steril bir petri kabına yerleştirin. </li><li> Şekil 4 ve parafilm tüm derzlerinde belirtildiği gibi biyoreaktör akış sistemi birleştirin. <ol><li> Ilk konektörler alkollü mendil ile silin. </li><li> Biyoreaktör üçüncü, kullanılmayan kol enjeksiyon portuna takın. </li><li> Mors tüpünü çıkarın ve Y-kavşak mümkün olduğunca yakın tuzlu seyreltme sonunda mavi kravat. Tüp bu bölümü için hiçbir sıvı transferi sağlamak için yerinde tüp kelepçe çekin </li><li> IV çantayı çıkarın, mors tüp (kırmızı) IV çanta öbür ucuna takın. Önce alkol ile silin ekleme portu temizlemek için emin olun. </li><li> (Beyaz sonuna tüp yoluyla) akış sisteminin bir tarafa mors takın. </li><li> 3-yollu akış sistemi içine stopcock yerleştirin. </li><li> Basınç dönüştürücü çıkarın ve üç yollu stopcock bağlanın. </li><li> Çanta orta açılış basınç dönüştürücü diğer ucunu takın. </li></ol></li><li> BağlamakY-kavşak üzerinden akış sistemi biyoreaktör. IV çanta 350ml% 1 fungizone ekleyin (PBS 495ml ile karıştırın 5ml fungizone) 60ml bir şırınga kullanın. </li><li> PBS akışına izin vermek için stop musluklar ayarlayarak akan sistemini temizlemek için IV çanta sıkın. Not: biyoreaktör içinde hiçbir sızıntı sağlamak için kontrol edin. </li><li> Her PGA scafffold üzerine orta ve tohum 1.25ml 8 x10 6 SMC'lere (yaklaşık bir konfluent T75) yeniden askıya. Düzgün PGA örgü alt yüzüne yanı sıra hücre süspansiyonu PGA mesh-Dacron kavşak üzerine damladı olmuştur emin olun. </li><li> Biyoreaktör alkol ile ağız yana gezinip önlemek biyoreaktör dönen üzerinden silin silin. </li><li> Silikon stoper kapak düzeneğini (Şekil 2) <ol><li> Geri dikkatle otoklav torbası Peel, kapağın altındaki maruz kalmaması için emin olun. </li><li> Erkek konnektör beslenme tüpüne enjeksiyon portu takın. </li><li> Her üç hava limanlarından PTFE 0.20 mikron filtreleri takın. </li><li> Bu işlem sırasında açığa / alt kapak dokunmamaya dikkatli olun. </li><li> Parafilm enjeksiyon portu. </li></ol></li><li> Cam biyoreaktör içine silikon tıpa kapağını takın ve biyoreaktör içindeki beslenme tüpü numaralı seribaşı PGA iskeleleri dokunmatik olmadığından emin olun. Kapağı etrafında Parafilm. </li><li> Inkübatör içindeki akış sistemi (yan) biyoreaktör yerleştirin ve 25-30 dakika boyunca her 5 dakikada bir biyoreaktör döndürmek. </li><li> 400ml (Tablo 1) açıklandığı gibi 4-10 kültür ortamı ile biyoreaktör odasına doldurun. Bu kültür ortamı domuz mühendislik arterler için "optimize" dir. </li></ol> 6. Gün 6-7: Pompa açılması ve İlk Besleme <ol><li> 6-7 gün için silikon tüp yoluyla herhangi bir pulsatil pompa olmadan statik numaralı seribaşı iskele büyütün. Bu süre içinde orta değişikliği ya da C vitamini takviyesi için gerek yoktur. </li><li> PBS veya bükülme akış sistemi boru pompa açmadan önce herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun. </li><li> Akış sistemi pompa açın ve basıncı yaklaşık 270/-30mmHg okur, böylece pompa ayarı ayarlamak için emin olun. </li><li> Kayıt kültür boyunca günlük baskılar ve 270/-30mmHg basınç korumak. Basınç detektörler basıncını okumak ve izlemek için bir bilgisayara bağlanabilir. </li></ol> İlk Besleme <ol start="5"><li> Orta değişim ve orta atık azletme amaçlar için kapakları beslenme üzerine enjeksiyon portu ve PTFE filtre birleştirin. </li><li> Beslenme tüpü sıkıca pompa yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktör ve diğer ucunu besleme kapağı liman besleme. Etanol mendil ile enjeksiyon noktaları temizlemek için emin olun. </li><li> Orta 200ml dışarı pompalamak için çift yönlü Masterflex pompa kullanın. Ardından yeni bir beslenme tüpü biyoreaktör geri taze orta 200ml pompa kullanın. Her zaman, orta ve arka biyoreaktör pompalama özellikle çok yavaş bir hız ile başlar. </li><li> Orta ve ek askorbik asit 2x/week değiştirin. Askorbik asit eklemek için, orta 25ml ve doku kaputu bir kenara yerleştirmek için 30ml şırınga kullanabilirsiniz. PBS 5ml 25mg askorbik asit çözülür ve 0,22 mikron filtresi ile filtre. Öncelikle beslenme tüpü içine steril askorbik asit enjekte ve daha önce alınan 25ml orta geri ekleyin. Orta tarifi Tablo 1'de verilmiştir. </li></ol> 7. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. Akış sisteminin montajı için boru ve konektörler yukarıda gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Silikon tıpa kapak düzeneğini yukarıda gösterilmiştir. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Biyoreaktör montaj Şemalar yukarıda gösterilmiştir. Biyoreaktör Dacron manşet mavi dikiş knot cam silah üzerine sabitlenmiş olan İç. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. Tüp ve biyoreaktör bağlı akış sistemi yukarıda gösterilmiştir. L/S18 boru Masterflex pompa ile pompalanır ve akış böylece sürüş olacak. Basınç dönüştürücü üst akım biyoreaktör girmeden önce basıncını ölçmek. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig5.jpg" alt="Şekil 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 5"> Şekil 5. Hasat mühendislik geminin Resim Engineered damarların opak görünür ve pulsatil koşullar altında, 8 hafta kültürü sonra bir duvar kalınlığı yaklaşık 250μm ulaşacaktır . <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig6.jpg" alt="Şekil 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 6"> Şekil 6. Mühendislik gemilerin Hematoksilen ve Eosin boyanan kesitler. A ve B sırasıyla, gemilerin 8 hafta non-darbeli ve darbeli.C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. L gemilerin luminal tarafında gösterir. Terazi bar 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig7.jpg" alt="Şekil 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 7"> Şekil 7. Kollajen için tasarlanmış gemilerin kesitler Masson trikrom lekeleri (mavi), A ve B sırasıyla 8 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri, . C ve D, sırasıyla 4 hafta non-darbeli ve darbeli gemileri,. 4 hafta darbeli gemi olmayan darbeli meslektaşı daha fazla kolajen gösterir unutmayın. Beyaz oklar gemilerin PGA parçaları kalan noktası. Terazi bar 100μm. <img src="/files/ftp_upload/2646/2646fig8.jpg" alt="Şekil 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 8"> Şekil 8. Sığır mühendislik arterlerde SMC belirteçlerin İmmünokimya boyama. Düz kas α-aktin calponin-1, ve düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) sırasıyla erken, orta ve geç SMC kontraktil belirteçler. 12 haftalık kültür sonuna kadar, gemi hücreleri duvar ifade SM α-aktin ve orta miktarda Calponin-1 ve SMMHC. Terazi bar 20μm. <table border="1"><tbody><tr><td> Bileşen </td><td> Miktar </td></tr><tr><td> DMEM (DME / düşük değiştirilmiş) </td><td> 500 ml </td></tr><tr><td> FBS (fetal sığır serum) ısı inaktive </td><td> 100 ml. </td></tr><tr><td> Hepes 1.0 M </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> C vitamini (PBS ya da DMEM çözünmüş) </td><td> 25 mg </td></tr><tr><td> Proline / Glisin / Alanin 25 mg/25 mg/10 mg (PBS 5ml içinde çözünmüş) </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> CuSO 4 1.5 mg (PBS in1 ml çözünmüş) </td><td> 1ml </td></tr><tr><td> Penisilin 10.000 adet G / ml </td><td> 5ml </td></tr><tr><td> 10 ng PDGF-BB (trombosit kaynaklı büyüme faktörü-BB) </td><td> 5μg </td></tr><tr><td> 10 ng bFGF (temel fibroblast büyüme faktörü) </td><td> 5μg </td></tr></tbody></table> Tablo 1. "4-10" orta Bileşenleri yukarıdaki tabloda gösterilmiştir. PDGF-BB ve bFGF hariç, diğer tüm bileşenleri kullanmadan önce 0.2μm filtre süzgecinden edilmelidir.

<ol><li>Risau, W., Flamme, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vasculogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Cell+Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Vasculogenesis.</a> Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 11, 73-91 (1995).</li>
<li>Fankhauser, F., Bebie, H., Kwasniewska, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Influcence+of+mechanical+Forices+and+Flow+Mechanisms+on+Vessel+Occlusion%5BTitle%5D)+AND+%22Lasers+in+Surgery+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">The Influcence of mechanical Forices and Flow Mechanisms on Vessel Occlusion.</a> Lasers in Surgery and Medicine. 6, 530-532 (1987).</li>
<li>Niklason, L. E., Gao, J., Abbott, W. M., Hirschi, K. K., Houser, S., Marini, R., Langer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+arteries+grown+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Functional arteries grown in vitro.</a> Science. 284, 489-493 (1999).</li>
<li>Prabhakar, V., Grinstaff, M. W., Alarcon, J., Knors, C., Solan, A. K., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+porcine+arteries%3A+Effects+of+scaffold+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research+Part+A%22%5BJournal%5D)">Engineering porcine arteries: Effects of scaffold modification.</a> Journal of Biomedical Materials Research Part A. 67A, 303-311 (2003).</li>
<li>Mitchell, S. L., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirements+for+growing+tissue-engineered+vascular+grafts%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Pathology%22%5BJournal%5D)">Requirements for growing tissue-engineered vascular grafts.</a> Cardiovascular Pathology. 12, 59-64 (2003).</li>
<li>Dahl, S. L. M., Rhim, C., Song, Y. C., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+and+compositions+of+tissue+engineered+and+native+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties and compositions of tissue engineered and native arteries.</a> Annals of Biomedical Engineering. 35, 348-355 (2007).</li>
<li>Quint, C., Kondo, Y., Manson, R. J., Lawson, J. H., Dardik, A., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+tissue-engineered+blood+vessel+as+an+arterial+conduit%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Decellularized tissue-engineered blood vessel as an arterial conduit.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108, 9214-9219 (2011).</li>
<li>Niklason, L. E., Yeh, A. T., Calle, E. A., Bai, Y., Valentín, A., Humphrey, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+Tools+for+Engineering+Collagenous+Tissues+Integrating+Bioreactors%2C+Intravital+Imaging%2C+and+Biomechanical+Modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Enabling Tools for Engineering Collagenous Tissues Integrating Bioreactors, Intravital Imaging, and Biomechanical Modeling.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 3335-3339 (2010).</li>
<li>Gong, Z., Calkins, G., Cheng, E. -c, Krause, D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+Culture+Medium+on+Smooth+Muscle+Cell+Differentiation+from+Human+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Influence of Culture Medium on Smooth Muscle Cell Differentiation from Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells.</a> Tissue Engineering Part A. 15, 319-330 (2009).</li>
<li>Gong, Z. D., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-diameter+human+vessel+wall+engineered+from+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells+%28hMSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Faseb+Journal%22%5BJournal%5D)">Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs.</a> Faseb Journal. 22, 1635-1648 (2008).</li>
<li>Poh, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood+vessels+engineered+from+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Blood vessels engineered from human cells.</a> Lancet. 365, 2122-2124 (2005).</li>
<li>American Heart Association. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biostatistical+fact+sheet%3A+cardiovascular+procedures%22">Biostatistical fact sheet: cardiovascular procedures</a>. , American Heart Association. (2002).</li>
</ol>

Tasarlanmış gemilerin kalitesini büyük ölçüde doku kültüründe kullanılan SMC&#39;lere kalitesini tarafından dikte. SMC fenotip kritik yönleri kontraktil morfolojisi, düşük geçit sayısı ve biyoreaktör içinde prolifere yeteneği içerir. Biz geçit sayısı polimer iskele üzerine hücre tohumlama zamanında P3 daha büyük olması önerilir. Ayrıca, SMC kaynakları kullanmadan önce mycoplasma özgür olduğunu onaylamak için çok önemlidir. Biz mycoplasma-kontamine hücreler biyoreaktör kültürü hücresel proliferasyonu ve kollajen matriks ...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif / Malzeme Adı </th><th> Satıcı </th><th> Katalog Numarası </th></tr><tr><td> FBS (fetal sığır serumu) Isı-İnaktive </td><td> HyClone </td><td> SH30071 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11885 </td></tr><tr><td> rhFGF-Basic </td><td> R &amp; B </td><td> 234-FSE </td></tr><tr><td> rrPDGF-BB </td><td> R &amp; B </td><td> 520-BB </td></tr><tr><td> Penisilin G </td><td> Sigma </td><td> Penna </td></tr><tr><td> Bakır (II) Sülfat </td><td> Sigma </td><td> C8027 </td></tr><tr><td> Gylcine </td><td> Sigma </td><td> C8790 </td></tr><tr><td> L-Alanin </td><td> Sigma </td><td> A7469-25G </td></tr><tr><td> L-prolin </td><td> Sigma </td><td> P5607-25G </td></tr><tr><td> Askorbik asit </td><td> Sigma </td><td> A4544-25G </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Sigma </td><td> H3375-100G </td></tr><tr><td> Silikon Stopper </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06298-24 </td></tr><tr><td> Masterflex borular L / S </td><td> Cole-Parmer </td><td> 06.508-16, 06.508-18 </td></tr><tr><td> Masterflex pompa </td><td> Cole-Parmer </td><td> 7553-80 </td></tr><tr><td> Dacron manşet </td><td> Maquet </td><td> 174406 </td></tr><tr><td> PGA hissettim </td><td> Concordia </td><td> MO000877-01 </td></tr><tr><td> 4-0 1.5 metrik Surgipro II sütür </td><td> Syneture </td><td> VP-557-X </td></tr><tr><td> 6-0 0.7 metrik Dexon sütür </td><td> Syneture </td><td> 7538-11 </td></tr><tr><td> 0.22μm PTFE filtreleri </td><td> Whatman </td><td> 6780-2502 </td></tr><tr><td> Üç Yönlü Stop-horoz </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> 593WSC </td></tr><tr><td> Basınç Transducer </td><td> Edwards Lifesciences </td><td> PX212 </td></tr><tr><td> IV çanta </td><td> Baxter </td><td> R4R2110 </td></tr><tr><td> Tuzlu seyreltme seti </td><td> Ok </td><td> W20030 </td></tr><tr><td> Silikon tüp </td><td> Saint-Gobain </td><td> F05027 </td></tr></tbody></table>

pulsatif biyoreaktör kullanarak mühendislik biyolojik tabanlı vasküler greftler

Engineering Biological-Based Vascular Grafts Using a Pulsatile Bioreactor

Fonksiyonel küçük çaplı arteriyel atlar yeniden metodoloji geliştirmek ve ilerletmek için çok çaba ayrılmış oldu. Fizyolojik bir ortamda, hem mekanik hem de kimyasal stimülasyon arter damarlarının 1,2 düzgün gelişimi ve işlevleri korumak için gereklidir. Grubumuz tarafından geliştirilen Biyoreaktör kültür sistemleri, yerli damarları taklit bir tam kontrollü kemo-mekanik bir ortam içinde gemi yenilenmesini desteklemek üzere tasarlanmıştır. Bizim biyoreaktör montaj ve bakım işlemleri oldukça basit ve 3,4 yüksek tekrarlanabilir. Düz kas hücreleri (SMC&#39;lere) uyumlu silikon tüp içinde 12 hafta veya pulsatil uyarı olmaksızın dişli ve biyoreaktör kültüre bir tübüler Poliglikolik asit (PGA) örgü üzerine numaralı seribaşı. Bazı öncekilerden biyoreaktör ayırt dört temel nitelik vardır. 1) sadece yerel kan damarlarının etrafındaki biyokimyasal simüle diğer kültür sistemlerinin aksine, bizim biyoreaktör kültür gemilere siklik radyal gerilme uygulayarak fizyolojik pulsatil bir ortam oluşturur. 2) Birden fazla mühendislik gemilerin kontrollü bir kimyasal ortam içinde farklı mekanik koşullar altında aynı anda yetiştirilebilir. 3) biyoreaktör hayvan implantasyon modeller için tasarlanmış gemilerin luminal yüzüne kolayca kaplanabilir endotel hücreleri bir tek katman (EC) sağlar. 4) Ayrıca biyoreaktör, belirli bir çap boyutuna uyacak şekilde tasarlanmış gemilerin değişik çap büyüklüğü ile kültür, her bireyin biyoreaktör uyarlamak için çaba harcamadan, 1 mm den 3 mm arasında değişiyordu. Bizim biyoreaktör kültürü tasarlanmış gemilerin, belli bir dereceye kadar doğal kan damarlarının histolojik olarak benzerler. Damar duvarlarındaki hücreler, düz kas miyozin ağır zincir (SMMHC) 3 gibi olgun SMC kontraktil belirteçlerinin ifade eder. Önemli bir miktarda kolajen mühendislik damarları 5 nihai mekanik dayanım sorumlu ekstraselüler matriks içinde yatırılır. Biyokimyasal analizler de mühendislik damarların kollajen içeriği, ana arterler 6 ile karşılaştırılabilir olduğunu gösterir . Önemlisi, pulsatil biyoreaktör sürekli hayvan modellerinde 3,7 başarılı implantasyon deneyleri izin mekanik özellikleri sergileyen damarları yeniden. Ayrıca, bu biyoreaktör bir non-lineer optik mikroskobu (NLOM) 8 kullanarak kollajen remodeling zamanla gerçek zamanlı değerlendirilmesi ve takibi, non-invaziv, daha izin değiştirilebilir. Sonuç olarak, bu biyoreaktör fonksiyonel küçük çaplı vasküler greft rejenerasyon düzenleyen temel mekanizmaları incelemek için mükemmel bir platform olarak hizmet etmelidir.

Grubumuz, kardiyovasküler sistem fizyolojik pulsatil gerilmeler implante küçük çaplı vasküler greft yeniden taklit eden bir biyoreaktör kültür sistemi geliştirmiştir.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Fonksiyonel, küçük çaplı arteriyel baypasların rejenerasyonu için metodolojilerin geliştirilmesine ve ilerletilmesine büyük çaba sarf edilmiştir. Fizyolojik...

Bu prosedürün genel amacı, pulsatif bir biyoreaktör sistemi kullanarak biyolojik tabanlı vasküler greftler üretmektir. Bu işlem, hücrelerin üzerinde büyüyeceği PGA ağından biyobozunur bir iskele hazırlanması ve bunların bir biyoreaktör haznesine yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İskeleler daha sonra düz kas hücreleri ile ekilir ve hava ile besleme tüpü sızdırmazlık contalarına sahip bir kapak biyoreaktör haznesini kapatır.Biyoreaktör, biyoreaktördeki damarlara pulsatif akış sağlamak amacıyla bir akış sistemine bağlanır. Reaktörde hücreler; immünokimyasal, biyokimyasal ve mekanik testleri geçen damarlara dönüşerek büyür. Bu tekniğin etkileri, arteriyel bypass için implante edilebilir küçük çaplı vasküler greftlerin rejenerasyonuna yönelik gelecek vaat eden bir yaklaşım olması nedeniyle koroner arter hastalığının tedavisine kadar uzanmaktadır.Bu yöntem vasküler mühendislik konusunda içgörü sağlayabilse de, döngüsel fizyolojik kuvvetler altında olan diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler başlangıçta zorluk yaşayacaktır. Becerilerde tam yetkinlik kazanmak için yoğun pratik yapmanız gerekecektir.Mühendislik yapılarını yeniden canlandırmak için fizyolojik mekanik stimülasyon uygulamanın önemini fark ettiğimizde, bu yaklaşım için ilk fikri geliştirdik. Biyoreaktör uygulama süreçleri birçok adım içerdiği için öğrenilmesi zor olduğundan ve yalnızca detaylı bir gösterim yoluyla edinilebildiğinden, bu yöntemin görsel olarak sunulması kritik öneme sahiptir. Başlamak için, 3 mm iç çaplı silikon tüplerin 30 cm uzunluğundaki bölümlerini temizlemek için distile su kullanın ve havada kurumaya bırakın.Her bir tüp parçası için makas kullanarak 1,1 santimetreye sekiz santimetre boyutlarında bir PGA mesh bölümü kesin; bir hemostatt kullanarak PGA mesh'i tüpe Dexon 6.0 sütür ile sabitleyin, üç adet cerrahi düğüm atın ve hemostat ile tekli dikişlerle devam edin; sabitlenen mesh, bir PGA iskeleti oluşturur. İskeletleri önce bir molar sodyum hidroksite bir ila iki dakika daldırarak ve ardından her biri iki dakika sürecek şekilde üç kez distile suya daldırarak yıkayın. Yıkamalar arasında hafifçe kurulayın ve üçüncü yıkamadan sonra bir çeker ocakta 15 dakika boyunca hava ile kurumaya bırakın.Kuruduktan sonra, her bir ağ ucuna üç dikişle bir santimetrelik Dacron manşetler dikin. İki ila üç milimetrelik bir tüp örtüşmesi bırakın ve tüpü delmeyin. Bu protokolde daha sonra kullanılmak üzere yaklaşık 15 santimetre boş dikiş ipi bıraktığınızdan emin olun.Tüm biyoreaktör bileşenleri ve araçları önceden otoklavlanmıştır. Biyoreaktör kültürü başlatılmadan bir gün önce, biyoreaktör kısmen monte edilmeli ve biyoreaktör bileşenleri, iskeleler, gözenekli silikon hortumlar, cerrahi aletler ve biyoreaktör uzunluğundan daha uzun olan ince bir tel, daldırılmış halde en az 30 dakika boyunca %70 etanol banyosunda bekletilmelidir. Silikon hortumu reaktörün yan kolları üzerinden çekmek için teli kullanın.Şimdi biyoreaktörü çıkarın ve Dacron manşetleri genişletilmiş cam dudakların üzerine sabitleyerek PGA iskelelerini içeriye yerleştirin. Her bir manşeti bağlamak için fazla sütürü kullanın. Ardından, konnektörleri kullanarak iskelenin bir tarafındaki silikon tüpü biyoreaktör kollarının bir çiftine, iskelenin diğer tarafındaki tüpü ise diğer iki kola bağlayın.Konnektörler takıldığında, bunları yan kollardan çıkarın ve biyoreaktörü etanol ile yıkayın. Reaktörü her iki taraf için 10 dakika boyunca bekletin. Biyoreaktörü Petri kaplarının üzerine yerleştirin ve doku kültürü ortamı ile yıkayın.Suyu derecelendirin. Bir pipet kullanarak, süzgeç ve boruların da yıkandığından emin olun. Şimdi, ileride kullanmak üzere reaktörün içine steril bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin ve bu noktadan itibaren cihazı, çeker ocakta hava üfleyici açık ve UV ışığı kapalı konumdayken gece boyunca kurutun.Kontaminasyona yol açabileceği için reaktörün üzerine eğilmeyin. Kurulum sırasında tüm konektörler alkol ile silinerek temizlenmelidir. Bağlantılar yapılmadan önce eklemlerin çoğu, uygulanmadan önce %70 ethanol içinde bekletilmesi gereken paraform ile güçlendirilir. Bu nedenle her ikisinden de bol miktarda bulundurun.Önlem amacıyla, biyoreaktör içindeki PGA iskelelerini kontaminasyondan korumak için her bir biyoreaktör açıklığının üzerine steril bir Petri kabı yerleştirin. Şimdi, enjeksiyon portunu biyoreaktörün üçüncü boş koluna takarak kurulumu başlatın. Ardından, IV torbasını akış sistemine bağlayın.Walrus tüp setiyle, mavi ucu Y bağlantısına mümkün olduğunca yakın bir noktadan bağlayın ve tüpü klempleyiniz. Kırmızı tüpü IV torbasının uzak ucuna takın. Ardından beyaz tüpü akış sisteminin bir yanına bağlayın.Akış sistemine üç yollu bir musluk yerleştirin. Basınç dönüştürücü tüpünün bir ucunu musluğa, diğer ucunu ise IV torbasının orta açıklığına takın. Akış sistemini kısmen doldurmak ve sızıntı kontrolü yapmak için IV torbasına 350 milliliters PBS ve %1 fungi zone ekleyin.Akış sistemine bağlamadan önce veya bağladıktan sonra 60 mililitrelik bir şırınga kullanarak, PBS'nin akış yönünü kontrol etmek için musluğu ayarlayın ve sistemi durulamak için torbayı sıkın. Bu adım, hücre yerleştirme işleminden önce veya sonra gerçekleştirilebilir. Artık hücreler biyoreaktöre yerleştirilebilir.Bu örnekte, yaklaşık bir konfluent T 75'e denk gelen 8 milyon SM hücresini 1,25 mililitre besiyerinde süspande edin ve Dacron bağlantı noktasından diğer Dacron bağlantı noktasına kadar PGA iskeletinin üzerine eşit şekilde damlatın. Hücreleri ekledikten sonra, biyoreaktörün kenarını alkol ile temizleyin. Reaktörün üzerinde başınızla eğilmeyin.Ardından, silikon tıpa kapağı dikkatlice monte edin. Kapağın alt kısmının, otoklav torbasından çıkarılırken veya sonraki bağlantı adımlarının herhangi birinde dış ortamla temas etmediğinden emin olun. İlk olarak, enjeksiyon portunu besleme tüpündeki erkek konnektöre takın.İkinci olarak, üç giriş portunun her birine 0,20 mikronluk PTFE filtreler takın. Üçüncü olarak, enjeksiyon portunu kapatın. Birleştirilmiş silikon tıpa kapağını cam biyoreaktörün içine yerleştirin.Besleme tüpünün yerleştirilmiş PGA iskelelere temas etmediğinden emin olun. Ardından parafilm ile sızdırmaz hale getirin. Şimdi biyoreaktörü akış sistemine bağlayın; biyoreaktörü ve akış sistemini 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.Reaktör, 25 ila 30 dakika boyunca yan tarafına getirilmeli ve her beş dakikada bir döndürülmelidir. Ardından, inkübatördeyken, biyoreaktör haznesi bir pompa aracılığıyla besleme tüpü kullanılarak 400 mililitre dört ila 10 kültür medyası ile doldurulur. Şimdi, ekilmiş iskeleleri herhangi bir pulsatif pompalama yapmadan 37 °C'de ve %5 karbondioksit altında altı ila yedi gün boyunca inkübe edin.Pompayı çalıştırmadan önceki bu süre zarfında besiyeri değişimine veya vitamin C takviyesine gerek yoktur; tüplerde sızıntı veya kıvrılma olup olmadığını kontrol edin. Ardından, -30 ile 270 mmHg arasında bir basınç aralığını korumak için pompanın hız ayarını yapın. Kültür boyunca bu basıncı günlük olarak izleyin ve koruyun.İskele, taze besiyeri sağlamak için pulsatif pompalama ile büyütülürken, besiyeri değişimleri ve askorbik asit takviyesi haftada iki kez yapılmalıdır; önce, hem besiyeri değişimi hem de atık besiyerinin uzaklaştırılması amacıyla enjeksiyon portunu ve PTFE filtreyi besleme kapaklarına takın. Ardından, besleme tüpünü çift yönlü pompaya sıkıca yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktörün besleme portuna, diğer ucunu ise besleme kapağına takın. Şimdi, 200 mililitre besiyerini yavaşça pompalamaya başlayın.Pompa hızı kademeli olarak artırılabilir. Ardından yeni bir besleme tüpü takın ve yavaşça 200 mililitre taze besiyeri pompalamaya başlayın. Reaktöre askorbik asit eklemek için, steril 30 mililitrelik bir şırınga kullanarak 25 mililitre besiyerini çekip çıkarın.Beş mililitre steril askorbik asit çözeltisi ekleyin ve ardından 25 mililitreyi geri tamamlayın. Mühendislik ürünü damarlar, sekiz haftalık kültürden sonra opak görünecek ve yaklaşık 250 mikron duvar kalınlığına ulaşacaktır. Pulsatil koşullar altında, mühendislik ürünü damarların hematoksilin ve eozin boyamaları, doku morfolojisi değişimlerinin zamanla ve nabızla birlikte gerçekleştiğini göstermektedir.Damarların lüminal tarafı L ile belirtilmiştir; Masson's trichrome boyaması kollajeni göstermektedir ve dört haftalık darbeli damarın, darbesiz olan karşılığına göre daha fazla kollajene sahip olduğu görülmektedir; beyaz oklar 12. haftada damarlarda kalan PGA fragmanlarını göstermektedir. İmmünokimyasal analiz; erken düz kas markörü alfa aktin, orta dönem düz kas markörü calponin-1 ve geç dönem düz kas markörü miyozin ağır zincir ekspresyonunu göstermektedir. Uzmanlaşıldığında, bu teknik uygun şekilde uygulandığı takdirde yedi ila sekiz saat içinde tamamlanabilir.Bu prosedür uygulanırken, tüm işlemlerin bu prosedürü takip ederek mümkün olduğunca temiz ve steril şekilde gerçekleştirilmesi gerektiğini unutmamak önemlidir. Geliştirme aşamasından sonra, in vivo çalışmalar sırasında mühendislik ürünü damarların korunmasında lüminal yüzey modifikasyonunun önemi gibi ek soruları yanıtlamak için, mühendislik ürünü damarların lümeninin modifikasyonu gibi diğer yöntemler uygulanabilir.Bu teknik, doku mühendisliği ve özellikle damar mühendisliği alanındaki araştırmacıların, hayvan modellerinde koroner arter hastalıklarını tedavi etmeye yönelik potansiyel yöntemleri keşfetmelerine zemin hazırlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik bir post-kültür yoluyla implante edilebilir mühendislik ürünü vasküler greftlerin nasıl elde edileceği konusunda kapsamlı bir bilgiye sahip olacaksınız. Sodyum hidroksit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken göz koruması ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.

engineering-biological-based-vascular-grafts-using-pulsatile

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Pulsatil akış biyoreaktör kültürü damar düz kas hücreleri ile Elastomerik PGS iskeleler, görece kısa bir kültür dönemde, yerli ECM üretim ile gelecek vaat eden küçük çaplı arter yapıları neden olabilir.

Elastomerik PGS Arter Doku Mühendisliği Yapı iskeleleri

Hayvan kurban kadar in vivo uçtan uca anastomoz ve gerçek zamanlı dijital değerlendirme kullanarak bir koyun karotis artere Doku Engineered Gemiler (Tevs) arası pozisyonel yerleştirme için bir adım-adım protokolü.

Doku Engineered Vasküler Greftlerinin ve sonraki İmplantasyonunda Cerrahi Tekniği<em&gt; İn Vivo</em&gt; İzleme

Burada, biz çift tohumlama kısmen uyarılmış pluripotent kök hücre ile farelere aşılama için fonksiyonel doku mühendisliği gemi greft oluşturmak için bir protokol mevcut (PiPSC) - Bir decellularized damar iskele biyoreaktör üzerinde elde edilen endotel hücreleri - düz kas hücreleri ve PiPSC türetilmiş.

Bir Fare Modeli Doku mühendisliği Kapların Üretimi ve Tırnak

Bu çalışmada, kollajen, düz kas hücreleri ve endotel hücrelerinin doğrudan kültürlenmesi yoluyla canlı vasküler dokuların hızlı bir şekilde üretilmesi için bir teknik sunuyoruz. Ek olarak, tasarlanmış vasküler dokuların mekanik karakterizasyonu için yeni bir protokol tanımlanmıştır.

Vasküler Doku Rejenerasyon için Mühendislik 3D cellularized Kollajen jeller

Bu, bir doku mühendisliği odası içinde mikrocerrahi arteriyovenöz döngü veya akışlı bir pedikül konfigürasyonu kullanarak in vivo vaskülarize doku oluşturmak için bir kılavuzdur. Üretilen vaskülarize dokular, organ rejenerasyonu ve doku defektlerinin değiştirilmesinin yanı sıra ilaç testi ve hastalık modellemesi için de kullanılabilir.

Bir ıntrinsic Vaskülarizasyon tarafından Doku Mühendisliği<em&gt; İn Vivo</em&gt; Doku Mühendisliği Odası

Ölçeklenebilir mühendislik kan damarları klinik uygulanabilirliğini artıracaktır. Kolayca büyükçe 3D baskılı kılavuzları kullanarak, damar düz kas halkaları oluşturulan ve bir damar grefti oluşturan, boru şeklinde bir forma yığılmış. Greftler sadece 3D baskılı kılavuz boyutunu değiştirerek insan koroner arter boyutları aralığını karşılamak için büyüklükte olabilir.

3D Baskılı Kılavuzları ve Halka İstifleme Yöntemiyle Engineered Vasküler Greft ölçeklendirme

Biz nerede bir ikincil hücre tipi bozukluklarına doku ve organoids oluşturmak için bu microfibrous yapının interstisyel uzaya daha fazla numaralı seribaşı bir microfibrous vasküler yatağın mühendislik bir mikrosıvısal bioprinting strateji temel alan genel bir protokol sağlar.

Mikrosıvısal Bioprinting mühendisliği için doku ve Organoids skarların

Bakteriyel bağlılık doku grefti incelenmesi sağlar bir in-house tasarlanmış vitro akışı odası modeli açıklar.

Vitro modeli doku grefti bakteriyel bağlılık çalışmaya paralel-plaka perfüzyon sistemi

Bu protokolün amacı, kesme stresi ve döngüsel esnemenin birleşmesini sağlayan bir biyoreaktör kullanarak, malzeme güdümlü doku yenilenmesini araştırmak için tübüler elektrospun iskelelerinde insan makrofajları ve miyofibroblastların dinamik bir ortak kültürünü yürütmektir.

Akış ve Esneme Altında Biyomalzemelerin Enflamatuar ve Rejeneratif Kapasitesini Değerlendirmek için Çok İşaretli Bir Biyoreaktör

Bu protokol, perfüzyonda kan damarlarının ex vivo kültürü için yeni geliştirilen, 3D baskılı bir biyoreaktörün kurulumunu ve çalıştırılmasını sunar. Sistem, diğer kullanıcılar tarafından kolayca benimsenebilecek, pratik, uygun fiyatlı ve temel biyoloji ve farmakolojik çalışmalar gibi farklı deneysel uygulamalara uyarlanabilir şekilde tasarlanmıştır.

Ex Vivo (Canlı Canlı) 3D Baskılı Biyoreaktörde Büyük Kan Damarlarının Perfüzyon Kültürü

Burada, doku mühendisliği yapılmış bir vasküler greftin manşet tekniği kullanılarak fare karotis arterine implantasyonu için bir protokol sunulmakta ve vasküler doku rejenerasyon mekanizmalarının araştırılması için uygun bir hayvan modeli sağlanmaktadır.

Fare Karotis Arterine Manşet Tekniği ile Doku Mühendisliği Yapılmış Vasküler Greft İmplantasyonu

Öğrenin, pulsatif biyoreaktör kullanarak biyolojik temelli vasküler greftlerin nasıl mühendislikle üretildiğini. Bu yöntem, koroner arter hastalığı tedavisinde küçük çaplı damar greftleri oluşturmak için umut vadediyor.

Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Daha fazla video keşfet