Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Bu prosedürün genel amacı, pulsatil bir biyoreaktör sistemi kullanarak biyolojik bazlı vasküler greftler üretmektir. Bu, hücrelerin sıra halinde büyüyeceği PGA ağından biyolojik olarak parçalanabilen bir iskele hazırlanarak ve bunları bir biyoreaktör odasında monte ederek gerçekleştirilir. İskeleler daha sonra düz kas hücreleri ile oturtulur ve hava ve besleme tüpü içeren bir kapak biyoreaktör odasını kapatır.

Biyoreaktör daha sonra biyoreaktördeki kaplara pulsatil akış sağlamak için bir akış sistemine bağlanır. Reaktörde hücreler, immünokimyasal, biyokimyasal ve mekanik testlerden geçen damarlara dönüşür. Bu tekniğin etkileri koroner arter hastalığının tedavisine kadar uzanır, çünkü bu teknik, arteriyel baypas için implante edilebilir küçük çaplı vasküler greftlerin rejenere edilmesi için umut verici bir yaklaşımdır.

Bu yöntem vasküler mühendislik hakkında bilgi verebilse de, döngüsel fizyolojik kuvvetler altındaki diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni başlayan kişi mücadele edecektir. Becerilerde tam olarak ustalaşmak için çok fazla pratiğe ihtiyacınız olacak.

Bu yaklaşım fikrine ilk olarak, mühendislik yapılarını yeniden oluşturmak için fizyolojik mekanik stimülasyon uygulamanın önemini fark ettiğimizde sahip olduk. Bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir, çünkü biyoreaktör şarkı söyleme işleminin öğrenilmesi zordur, çünkü birçok adım vardır ve yalnızca ayrıntılı bir gösteri yoluyla elde edilebilir. Başlamak için, üç milimetre iç çaplı silikon borunun 30 santimetre uzunluğundaki bölümlerini temizlemek için damıtılmış su kullanın ve kurumaya bırakın.

Bir hemostat kullanarak her bir boru parçası için 1,1 santimetreye sekiz santimetrelik bir PGA ağ bölümünü kesmek için makas kullanın, böylece PGA ağı Dexon 6.0 sütür ile boruya üç cerrahi düğüm bağlar ve ardından hemostat ile tek dikişlerle takip edin, güvenli ağ bir PGA iskelesi yapar. İskeleleri önce bir ila iki dakika boyunca bir molar sodyum hidroksite batırarak ve ardından daldırma başına iki dakika boyunca damıtılmış suya üç daldırarak yıkayın. Yıkamalar arasında kurulayın ve üçüncü yıkamadan sonra 15 dakika boyunca bir kapüşonda kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, ağın her iki ucuna üç dikişle bir santimetre Dacron manşetleri dikin. İki ila üç milimetre boru örtüşmesi bırakın ve boruyu delmeyin. Bu protokolde daha sonra kullanmak üzere yaklaşık 15 santimetre serbest sütür bıraktığınızdan emin olun.

Tüm biyoreaktör bileşenleri ve araçları önceden otomatik olarak kapatılır. Biyoreaktör kültürüne başlamadan bir gün önce, biyoreaktör kısmen monte edilmeli, biyoreaktör bileşenleri iskelelere daldırılmalıdır, bu nedenle silikon boruları, cerrahi aletleri ve biyoreaktörün uzunluğundan daha uzun ince bir teli en az 30% 70 etanol banyosunda en az 30 dakika boyunca ağ altında tutun. Silikon boruyu reaktörün yan kollarından çekmek için teli kullanın.

Şimdi biyoreaktörden çıkın ve Dacron manşetlerini genişletilmiş cam dudakların üzerine sabitleyerek PGA iskelelerini içeriye takın. Her bir manşeti bağlamak için fazla dikişi kullanın. Daha sonra, konektörleri kullanarak, iskelenin bir tarafındaki silikon boruyu bir çift biyoreaktör kolu ile takın ve iskelenin diğer tarafındaki boruyu diğer iki kola takın.

Konektörler takıldığında, bunları yan kollardan dışarı çekin ve biyoreaktörü etanol ile yıkayın. Reaktörü her iki tarafta 10 dakika bekletin. Biyoreaktörü bazı Petri kaplarına yerleştirin ve doku kültürü ile yıkayın.

Dereceli su. Bir pipet kullanarak, ağı ve hortumu da yıkadığınızdan emin olun. Şimdi ileride kullanmak üzere reaktöre steril bir karıştırma çubuğu yerleştirin ve cihazı bu noktadan itibaren üfleyici açık ve UV kapalı olarak davlumbazda gece boyunca kurutun.

Kirlenmeye yol açabileceğinden reaktörün üzerine eğilmeyin Kurulum sırasında tüm konektörler alkolle silinerek temizlenmelidir. Ataşmanlar yapılmadan önce, eklemlerin çoğu, uygulanmadan önce% 70 etanole batırılması gereken paraform ile güçlendirilir. Bu yüzden her ikisinden de bol miktarda var.

Önlem olarak hazırda, içerideki PGA iskelesini kirleticilerden korumak için her biyoreaktör açıklığının üzerine steril bir Petri kabı yerleştirin. Şimdi enjeksiyon portunu biyoreaktörün kullanılmayan üçüncü koluna takarak kuruluma başlayın. Ardından, IV torbasını akış sistemine bağlayın.

Mors boru seti ile mavi ucu Y bağlantısına mümkün olduğunca yakın bağlayın ve tüpü sıkıştırın. Kırmızı boruyu IV torbasının uzak ucuna takın. Ardından beyaz boruyu akış sisteminin bir tarafına takın.

Akış sistemine üç yollu bir durdurma musluğu yerleştirin. Basınç dönüştürücü tüpünün bir ucunu durdurma musluğuna takın ve diğer ucunu IV torbasının orta açıklığına takın. Şimdi akış sistemini kısmen doldurmak ve sızıntı olup olmadığını kontrol etmek için IV torbasına 350 mililitre PBS ve% 1 mantar bölgesi ekleyin.

Akış sistemine bağlamadan önce veya sonra 60 mililitrelik bir şırınga kullanarak, PBS'nin akış yönünü kontrol etmek için vanayı ayarlayın ve sistemi yıkamak için torbayı sıkın. Bu adım, hücre oturmasından önce veya sonra yapılabilir. Artık hücreler biyoreaktöre oturtulabilir.

Bu örnekte, resus, 1.25 mililitre ortamda yaklaşık bir birleşik T 75 olan 8 milyon SM hücresini askıya alır ve bunları Dacron kavşağından Dacron kavşağına kadar PGA iskelesine eşit şekilde damlar. Hücreleri ekledikten sonra, biyoreaktörün kenarını alkolle silerek temizleyin. Reaktörün üzerine gelmekten kaçının.

Ardından, silikon tıpa kapağını dikkatlice monte edin. Otoklav torbasından çıkarılırken veya aşağıdaki bağlantı adımlarından herhangi biri sırasında kapağın altını açıkta bırakmadığınızdan emin olun. İlk olarak, enjeksiyon portunu erkek konektördeki besleme borusuna takın.

İkinci olarak, üç havaalanının her birine PTFE 0.20 mikron filtreleri takın. Üçüncü para, enjeksiyon portunu filme alın. Monte edilmiş silikon tıpa kapağını cam biyoreaktöre yerleştirin.

Besleme tüpünün oturan PGA iskelelerine temas etmediğinden emin olun. Sonra paraform ile kapatın. Şimdi biyoreaktörü akış sistemine bağlayın ve biyoreaktörü ve akış sistemini 37 santigrat derecelik bir inkübatörün içine yerleştirin.

25 ila 30 dakika boyunca reaktör yan yatırılmalı ve her beş dakikada bir döndürülmelidir. Daha sonra, hala inkübatördeyken, bir besleme tüpünden geçen bir pompa kullanarak biyoreaktör odasını 400 mililitre dört ila 10 kültür ortamı ile doldurun. Şimdi, tohumlanmış iskeleleri herhangi bir pulsatil pompalama olmadan altı ila yedi gün boyunca 37 santigrat derecede% 5 karbondioksit ile kuluçkaya yatırın.

Bu süre zarfında orta düzeyde değişikliğe veya C vitamini takviyesine gerek yoktur, pompayı açmadan önce boruda sızıntı veya bükülme olup olmadığını kontrol edin. Ardından, eksi 30 ila 270 milimetre cıva arasında bir basınç aralığını korumak için pompanın hız oranını ayarlayın. Bu baskıyı kültür boyunca günlük olarak izleyin ve koruyun.

Ortam değişiklikleri ve askorbik asit takviyesi haftada iki kez yapılmalıdır, iskele pulsatil pompalama ile büyürken, önce taze ortamı beslemek için, hem orta değişim hem de orta atık bertarafı amacıyla enjeksiyon portunu ve PTFE filtreyi besleme kapaklarına takın. Ardından, besleme borusunu çift yönlü pompaya sıkıca yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktörün besleme portuna ve diğer ucunu besleme kapağına yerleştirin. Şimdi yavaşça 200 mililitre ortamı pompalamaya başlayın.

Kademeli olarak pompa hızı artırılabilir. Ardından yeni bir besleme tüpü takın ve yavaşça 200 mililitre taze ortam pompalamaya başlayın. Reaktöre askorbik asit eklemek için, steril 30 mililitrelik bir şırınga kullanarak 25 mililitre ortamı çıkarın.

Beş mililitre steril askorbik asit çözeltisi ekleyin ve ardından 25 mililitreyi geri verin. Orta mühendislik ürünü kaplar opak görünecek ve sekiz haftalık kültürden sonra yaklaşık 250 mikronluk bir duvar kalınlığına ulaşacaktır. Pulsatil koşullar altında, mühendislik damarlarının hematik, toin ve eozin boyanması, zamanla ve nabızla doku morfolojisi değişikliklerini gösterir.

Damarların lümen tarafı bir L masson'un tri CHRO boyası ile gösterilir. Kollajen gösterileri için, dört haftalık darbeli damar, darbesiz muadilinden daha fazla kollajen içerir, beyaz oklar damarlarda 12 hafta boyunca kalan PGA fragmanlarına işaret eder. İmmünokimyasal analiz, erken düz kas belirteci alfa aktinin, orta düz kas belirteci cal poin one'ın ve geç düz kas belirteci miyozin ağır zincirinin ekspresyonunu gösterir Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa yedi ila sekiz saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben her şeyi mümkün olduğunca temiz ve steril bir şekilde gerçekleştirmeyi unutmamak önemlidir. Tasarlanmış kapların lümeninin modifikasyonu gibi diğer yöntemler, in vivo çalışmalar sırasında tasarlanmış gemilerin bakımında luminal yüzey modifikasyonunun önemi gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Geliştirildikten sonra.

Bu teknik, doku mühendisliği, özellikle vasküler mühendislik alanındaki araştırmacıların, hayvan modellerinde koroner arter hastalıklarını tedavi etmenin potansiyel yollarını keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik bir posta kültürü aracılığıyla implante edilebilir mühendislik vasküler greftlerinin nasıl elde edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Sodyum hidroksit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman göz koruması ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin kullanılması gerektiğini unutmayın.