Pulsatif Biyoreaktör kullanarak Mühendislik Biyolojik Tabanlı Vasküler Greftler

Bu prosedürün genel amacı, pulsatil bir biyoreaktör sistemi kullanarak biyolojik tabanlı vasküler greftler tasarlamaktır. Bu işlem, hücrelerin büyüyeceği PGA ağından biyobozunur bir iskele hazırlanması ve bunların bir biyoreaktör haznesinde birleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İskeleler daha sonra düz kas hücreleri ile ekimlenir ve hava ile besleme tüpü sızdırmazlığına sahip bir kapak biyoreaktör haznesini kapatır.

Biyoreaktör daha sonra, biyoreaktördeki damarlara pulsatif akış sağlamak amacıyla bir akış sistemine bağlanır. Reaktörde hücreler; immünokimyasal, biyokimyasal ve mekanik testleri geçen damarlar şeklinde büyür. Bu tekniğin doğurguları, arteriyel bypass için implante edilebilir küçük çaplı vasküler greftleri yeniden üretmek adına gelecek vaat eden bir yaklaşım olması nedeniyle koroner arter hastalığı tedavisine kadar uzanmaktadır.

Bu yöntem vasküler mühendislik konusunda içgörü sağlayabilse de, döngüsel fizyolojik kuvvetlere maruz kalan diğer organ sistemlerine de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemde yeni olan kişiler zorluk yaşayacaktır. Becerilerde tam uzmanlık kazanmak için yoğun pratik yapmanız gerekecektir.

Bu yaklaşım fikri ilk olarak, mühendislik yapılarını rejenerasyona uğratmak için fizyolojik mekanik stimülasyon uygulamanın önemini fark ettiğimizde ortaya çıktı. Biyoreaktör süreçleri çok sayıda adım içerdiği için öğrenilmesi zor olduğundan ve ancak detaylı bir gösterim yoluyla kavranabildiğinden, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir. Başlamak için, 3 mm iç çaplı silikon tüplerin 30 cm uzunluğundaki bölümlerini temizlemek için distile su kullanın ve havada kurumaya bırakın.

Her bir tüp parçası için bir hemostat kullanarak makasla 1,1 santimetreye sekiz santimetrelik bir PGA mesh bölümü kesin; ardından PGA mesh'i Dexon 6.0 sütürle tüpe sabitlemek için üç cerrahi düğüm atın ve hemostat ile tekli dikişlerle devam edin; sabitlenen mesh bir PGA iskelesi oluşturur. İskeleleri, önce bir molar sodyum hidroksit içine bir ila iki dakika daldırarak ve ardından her biri iki dakika sürecek şekilde distile suya üç kez daldırarak yıkayın. Yıkamalar arasında tampon yaparak kurulayın ve üçüncü yıkamadan sonra bir çeker ocak içinde 15 dakika boyunca havada kurumaya bırakın.

Kuruduktan sonra, mesh'in her iki ucuna üç dikişle bir santimetrelik Dacron manşetler dikin. İki ila üç milimetrelik bir tüp bindirmesi bırakın ve tüpü delmeyin. Bu protokolde daha sonra kullanılmak üzere yaklaşık 15 santimetre boş dikiş payı bıraktığınızdan emin olun.

Tüm biyoreaktör bileşenleri ve araçları önceden otoklavlanır. Biyoreaktör kültürü başlatılmadan bir gün önce, biyoreaktör kısmen monte edilmeli; biyoreaktör bileşenleri, iskeleler, gözenekli silikon hortumlar, cerrahi aletler ve biyoreaktör uzunluğundan daha uzun ince bir tel, daldırılmış halde en az 30 dakika boyunca %70 etanol banyosunda bekletilmelidir. Silikon hortumu reaktörün yan kollardan geçirmek için teli kullanın.

Şimdi biyoreaktörü çıkarın ve Dacron manşetleri genişlemiş cam dudakların üzerinden sabitleyerek PGA iskeleleri içeriye takın. Her bir manşeti bağlamak için fazla sütürü kullanın. Ardından, konnektörler yardımıyla iskelenin bir tarafındaki silikon tüpleri biyoreaktör kollarının bir çiftine, iskelenin diğer tarafındaki tüpleri ise diğer iki kola bağlayın.

Konektörler takıldığında, bunları yan kollardan çekip çıkarın ve biyoreaktörü etanol ile yıkayın. Reaktörü her iki taraf için 10 dakika boyunca bekletin. Biyoreaktörü Petri kaplarının üzerine yerleştirin ve doku kültürü ortamı ile yıkayın.

Suyu tahliye edin. Bir pipet kullanarak, filtrenin ve boruların da yıkandığından emin olun. Şimdi, ileride kullanmak üzere reaktöre steril bir manyetik karıştırıcı çubuk yerleştirin ve cihazı, bu noktadan itibaren çeker ocakta üfleyici açık ve UV kapalı konumda gece boyunca kurutun.

Kontaminasyona yol açabileceği için reaktörün üzerine eğilmeyin. Kurulum sırasında tüm konnektörler alkol ile temizlenmelidir. Bağlantılar yapılmadan önce, eklemlerin çoğu, uygulanmadan önce %70 etanol içinde bekletilmesi gereken paraform ile güçlendirilir. Bu nedenle her ikisinden de yeterli miktarda bulundurun.

Önlem olarak, içerideki PGA iskeletini kontaminasyonlardan korumak için her bir biyoreaktör ağzının üzerine steril bir Petri kabı yerleştirin. Şimdi, enjeksiyon portunu biyoreaktörün üçüncü boş koluna takarak kuruluma başlayın. Ardından, IV torbasını akış sistemine bağlayın.

Walrus tüp setiyle, mavi ucu Y eklemine mümkün olduğunca yakın bir yerden bağlayın ve tüpü klempleyin. Kırmızı tüpü IV torbasının uzak ucuna takın. Ardından beyaz tüpü akış sisteminin bir tarafına bağlayın.

Akış sistemine üç yollu bir stop musluğu yerleştirin. Basınç dönüştürücü tüpünün bir ucunu stop musluğuna, diğer ucunu ise IV torbasının orta açıklığına bağlayın. Akış sistemini kısmen doldurmak ve sızıntıları kontrol etmek için IV torbasına 350 milliliters PBS ve %1 fungi zone ekleyin.

Akış sistemine bağlamadan önce veya bağladıktan sonra 60 mililitrelik bir şırınga kullanarak, PBS akış yönünü kontrol etmek için musluğu ayarlayın ve sistemi yıkamak için torbayı sıkın. Bu adım, hücre yerleştirme işleminden önce veya sonra gerçekleştirilebilir. Artık hücreler biyoreaktöre yerleştirilebilir.

Bu örnekte, yaklaşık bir konfluen T 75'e denk gelen 8 milyon SM hücresini 1,25 mililitre besiyerinde süspanse edin ve Dacron ekleminden Dacron eklemine kadar PGA iskeletinin üzerine eşit şekilde damlatın. Hücreleri ekledikten sonra, biyoreaktörün kenarını alkol ile temizleyin. Reaktörün üzerinde öne eğilmekten kaçının.

Ardından, silikon tıpa kapağı dikkatlice birleştirin. Kapağın alt kısmının, otoklav torbasından çıkarılırken veya sonraki bağlantı adımlarının herhangi birinde dış ortama maruz kalmadığından emin olun. İlk olarak, enjeksiyon portunu besleme tüpündeki erkek konektöre takın.

İkinci olarak, üç hava giriş portunun her birine 0,20 mikronluk PTFE filtreler takın. Üçüncü olarak, enjeksiyon portunu kapatın. Montajı tamamlanmış silikon tıpa kapağı cam biyoreaktöre yerleştirin.

Besleme tüpünün yerleştirilmiş PGA iskelelerine temas etmediğinden emin olun. Ardından parafilm ile sızdırmaz hale getirin. Şimdi biyoreaktörü akış sistemine bağlayın ve biyoreaktör ile akış sistemini 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.

Reaktör 25 ila 30 dakika boyunca yan yatırılmalı ve her beş dakikada bir döndürülmelidir. Ardından, hala inkübatördeyken, bir pompa aracılığıyla besleme tüpü kullanılarak biyoreaktör haznesi 400 milliliters dört ila 10 kültür ortamı ile doldurun. Şimdi ekilmiş iskeleleri, pulsatif pompalama yapmadan 37 °C'de %5 karbondioksit ile altı ila yedi gün boyunca inkübe edin.

Pompayı çalıştırmadan önceki bu süre zarfında besiyeri değişimine veya C vitamini takviyesine gerek yoktur; önce borularda sızıntı veya bükülme olup olmadığını kontrol edin. Ardından, -30 ile 270 mmHg arasında bir basınç aralığını korumak için pompanın hız oranını ayarlayın. Kültür süresince bu basıncı günlük olarak izleyin ve koruyun.

İskele, taze besiyeri sağlamak amacıyla pulsatil pompalama ile büyütülürken, besiyeri değişimleri ve askorbik asit takviyesi haftada iki kez yapılmalıdır; önce, hem besiyeri değişimi hem de atık besiyeri tahliyesi amacıyla enjeksiyon portunu ve PTFE filtreyi besleme kapaklarına takın. Ardından, besleme tüpünü çift yönlü pompaya sıkıca yerleştirin ve bir ucunu biyoreaktörün besleme portuna, diğer ucunu ise besleme kapağına takın. Şimdi, 200 mililitre besiyerini yavaşça pompalamaya başlayın.

Pompa hızı kademeli olarak artırılabilir. Ardından yeni bir besleme tüpü takın ve yavaşça 200 milliliters taze besiyeri pompalamaya başlayın. Reaktöre askorbik asit eklemek için, steril bir 30 milliliters şırınga kullanarak 25 milliliters besiyeri çekin.

Beş mililitre steril askorbik asit çözeltisi ekleyin ve ardından 25 mililitreyi geri tamamlayın. Mühendislik ürünü damarlar, sekiz haftalık kültürden sonra opak görünecek ve yaklaşık 250 mikron duvar kalınlığına ulaşacaktır. Pulsatil koşullar altında, mühendislik ürünü damarların hematoksilin ve eozin boyaması, doku morfolojisindeki değişimlerin zamanla ve pulsasyonla birlikte gerçekleştiğini göstermektedir.

Damarların lüminal tarafı, Masson's tri CHRO boyaması ile L şeklinde belirtilmiştir. Kolajen gösterimi, dört haftalık pulsasyonlu damarın, pulsasyonsuz karşılığına göre daha fazla kolajene sahip olduğunu göstermektedir; beyaz oklar, 12. haftaya gelindiğinde damarlarda kalan PGA fragmanlarını işaret etmektedir. İmmünokimyasal analiz; erken düz kas belirteci alfa aktin, ara düz kas belirteci kalponin bir ve geç düz kas belirteci miyozin ağır zincir ekspresyonunu göstermektedir. Bu teknikte uzmanlaşıldığında, düzgün bir şekilde uygulandığı takdirde işlem yedi ila sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü uygularken, her adımın mümkün olduğunca temiz ve steril bir şekilde gerçekleştirilmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Mühendislik ürünü damarların in vivo çalışmaları sırasındaki korunmasında lüminal yüzey modifikasyonunun önemi gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla, damarların lümeninin modifikasyonu gibi diğer yöntemler de geliştirme sürecinin ardından uygulanabilir.

Bu teknik; doku mühendisliği, özellikle de vasküler mühendislik alanındaki araştırmacıların, hayvan modellerinde koroner arter hastalıklarını tedavi etmeye yönelik potansiyel yöntemleri keşfetmesinin önünü açmıştır. Bu videoyu izledikten sonra, dinamik postnatal kültür aracılığıyla implante edilebilir mühendislik ürünü vasküler greftlerin nasıl elde edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Sodyum hidroksit ile çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken göz koruması ve laboratuvar önlüğü gibi önlemlerin her zaman kullanılması gerektiğini unutmayın.