Name: Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2007-08-23T00:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 48 s
Description: Öğrenin, farelerde periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-foton görüntüleme yöntemini. CD4+ T hücre hareketliliğini in vivo görselleştirerek immünolojik araştırmalarda kullanın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Rebecca Paquette reaktif hazırlanması ile yardım için teşekkür etmek istiyoruz. MPM Ruth L. Kirchstein predoctoral dostluk Sağlık ve hibe GM-41.514 (MDC), NS-48.252 (KGC), Ulusal Sağlık Enstitüleri de GM-48.071 (IP) desteği Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmektedir.

1. Hücre evlatlık transferi: Kuyruk ven veya göziçi enjeksiyon uygun hücre izci etiketli ya da floresan protein ifade lenfositler tanıtımı için iki yöntem vardır. Bu videoda. biz kuyruk damar enjeksiyonu hücreleri evlatlık transfer göstermektedir. a. Malzemeler CD4 + T hücreleri 37 º C&#39;de 30 dakika süreyle 1.4 mcM KAKE ile etiketlenir, iki kez yıkanmış ve RPMI-1640 100 mcL yeniden askıya. Hücreler enjeksiyon için steril 28 gauge insülin enjektörü içine yüklenir. Kullanılan hücre sayısı deney yapılmaktadır bağlıdır. Tipik olarak, 5 milyon T hücreleri basit T hücre görünüm için yeterli değildir. Fare için bir kemirgen süzgeç, hayvan ve kendinize yaralanmayı önlemek için gereklidir. b. Hayvan güvenliğini sağlama Yavaş yavaş içine hayvan kemirgen süzgeç (video) destek ve pistonu hafifçe basılarak tüpün açık sonu kapanış fare tarafından evlat edinen transferi için güvence altına alınmıştır. Bu işlem sırasında bazı küçük hayvanlar süzgeç içinde dönüp gibi, fare kuyruğu gitmesine izin vermeyin. Bu yöntem, kendisi yaralandı ve enjeksiyon sırasında hareket hayvan önler. Kemirgen süzgeç kurarken, ileri atlama hayvan tutmak için gerekli daha ileri piston itmeyin. Ayrıca, uzun bir süre için süzgeç hayvan bırakmayın hayvana karşı piston itmeyin ve. c. Kuyruk ven görselleştirme Kuyruk parmağı üzerinden hafifçe sarılır ve baş parmağınızı parmak iç karşı düzenlenen böylece size doğru yavaşça çekin. Dik kuyruk iki tarafında bulunan kuyruk damarlar belirleyin. Görselleştirme sonra etanol ile silerek, ılık su ile kuyruk ısınmanın kolaylaştırılır. d. Hücre enjeksiyonu Ven yer olmuştur, sığ bir açı paralel damar şırınga konik tarafı yerleştirin. Ven, pistonu hafifçe bastırın; damar iseniz enjeksiyon NO direnç olmalıdır. HERHANGİ bir direniş var ise, şırınga kaldırmak ve farklı bir konuma içinde yeniden deneyin. Ven iseniz enjeksiyon tamamlanıncaya kadar, pistonu yavaşça bastırın. Enjeksiyon sırasında kuyruk şişmiş haline gelmemelidir. Eğer, bu iğne ven değildir anlamına gelir. Enjeksiyon sırasında damar &quot;kaybetmek&quot; için mümkündür. Bu durumda, iğne kaldırmak ve farklı bir noktaya enjeksiyon deneyin. Eğer birden fazla enjeksiyon denemesi gerekiyorsa, orijinal enjeksiyon yerinde farenin vücut doğru kuyruk yukarı taşımak için en iyisidir. Evlatlık transferi başka bir girişim için kendinizi odaya vermek için kuyruk distalde başlayarak bu olasılığı önceden planlayın. e. Post-enjeksiyon konuları Enjeksiyonu tamamlandıktan sonra, ven kan küçük bir geri akış meydana gelecektir. Kanama durana kadar temiz bir silme ile enjeksiyon yerinde hafifçe basın. Plenseri ve kuyruk üzerine hafifçe tutarak hayvan, süzgeç, ileri doğru yürümeye. Daima, hayvan bakımı komitesi ve hayvan kullanımını protokolleri ile uyum içinde olmasını sağlamak için kontrol edin. Gerçek deney denemeden önce bu tekniği birkaç kez uygulama için önemlidir. 2. Lenf Düğümü İzolasyon Iki foton görüntüleme için lenf nodu İzolasyonu dikkatli çevreleyen doku doğru lenf nodu çıkarılması gerektirir. a. Seçme ve periferik lenf nodu yeri Görüntüleme için lenf nodu Seçim deneysel hedeflerine bağlı olacaktır. Lokal enfeksiyon veya enjeksiyon drenaj lenf düğümleri farkında olun ve görüntüleme için uygun bir düğüm noktası seçin. Van den Broeck ve ark makale, detay 3 fare lenf nodu yeri ve morfolojisi açıklamaktadır. Bu video, hücre izolasyonu veya görüntüleme için uygun olan altı büyük periferik lenf nodu eksizyonu göstermektedir. b. Lenf nodu çıkarılması: Lenf düğümleri çıkarırken doku bütünlüğü göz önünde tutun. Rüptürü kapsül veya herhangi bir şekilde zarar lenf nodu yapısını değil dikkatli olun. Lenf nodu yapısal bütünlüğünü kaybı deneyi tehlikeye sokacaktır. Gerekirse, bir diseksiyon mikroskop altında ince diseksiyon (# 5 Dumont) forseps ile lenf nodu yüzeyindeki yağ çıkarın. Lenf düğümleri bu ışık saçılması görüntüleme belirsiz gibi, düğümün yüzeyinde kalan tüm yağ olmamalıdır. Uygun eksizyon lenf düğümleri de ilk gerçek deneyden önce uygulamaya önemli bir tekniktir. 3. Lenf Node Görüntüleme Kurulum ve Düşünceler Lenf nodu, bu durumda gömme odasının oluşan görüntüleme aşamasına kadar güvence altına alınmalıdır. Sıcaklaşır, oksijen-perfüze medya, peristaltik bir pompa ve inline ısıtıcı kullanılarak bir taraftan odasına pompalanır ve bir atık toplama şişesi bir vakum tüpü ile toplama odasına aşağı doğru kademeli bir kanal üzerinden çıkar. Sisteminde, lenf nodu, 37 batmış ° C medya ve medikal carbogen (% 5 CO 2,% 95 O 2) ile süper-perfüze . Perfüzyon medya sıcaklığı mümkün olduğu gibi, lenf nodu yakın olarak kayıt altına alınmalıdır. Belirli bir sistemi, medya akış hızı ve sahne tasarımı farklılıklar mikroskop sahne ve objektif karşılamak gerekebilir. a. Lenf nodu görüntüleme ayarları: Videoda görüldüğü gibi, biz ilk ekleyerek lenf nodu güvenli, uygun boyutta kesilmiş bir plastik lamel, aşağı medüller tarafı (image T veya B hücre bölgeleri dik bir mikroskop kullanılarak). Non-toksik bir doku yapıştırıcısı (3M Corporation&#39;ın VetBond ™) kullanmak önemlidir. Lamel sonra görüntüleme odasının cam tabanı bu kalarak, alt kapak kayma küçük bir silikon gres dab koyarak akan medya güvence altına alınmıştır. b. 2-Foton görüntüleme hususlar: Lenfositler hareketli durdurmak için çeşitli faktörler neden olabilir: çok yüksek veya çok düşük sıcaklık, aşırı lazer güç, sıkıştırma veya lenf nodu diğer hasar ve oksijen eksikliği. Aşırı lazer güç veya sıcaklıklara bağlı hasar&gt; ~ 39 ° C geri döndürülemez. Hücreler loş, dedektör kazanç ya da hücre-etiketleme protokolü yerine hücreleri görselleştirmek için daha yüksek bir lazer güç kullanarak daha artırmak için genellikle daha iyidir. Floresan proteinlerle etiketleme veya ifade optimizasyonu arka plan otofloresans seviyesinden floresan getirmek için gerekli olabilir. (Flow sitometri ile ölçülen) taban çizgisinin üstünde floresan bir iki günlük bir kayma konusunda makul bir kazanç ve lazer güç ayarları, hücre görünüm için makul. Uyarım için kullanılan dalga boyu ayarlanabilir iki foton lazerler ile görüntülü fluorofor çift tek foton uyarma maksimum biraz daha az olmalıdır. Birden fazla etiket veya floresan proteini kullanarak iki foton deneylerde, hem de etiketler için en iyi ayarları bulmak için kullanılan dalgaboyu deney için gerekli olabilir. İki foton uyarma aynı zamanda içsel mavi ikinci harmonik üretimi yararlanarak görüntü endojen kollajen yapılar için kullanılabilir. Ikinci harmonik üretimi (SHG) iki foton bir malzeme içinde kombine olduğu durumlarda meydana gelir ve orijinal fotonların iki kez frekans tek bir foton yayarlar. Doku, iki foton uyarma olay lazer ışığı gibi kollajen gibi bir çok sipariş edilen protein yapısında dik olduğu zaman oluşur. Önizleme yorum 4, 5 iki foton görüntüleme ile ilgili pratik konular tartışıldı .

<ol><li>Cahalan, M. D., Parker, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choreography+of+Cell+Motility+and+Interaction+Dynamics+Imaged+by+Two-Photon+Microscopy+in+Lymphoid+Organs.+Annu+Rev+Immunol%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Choreography of Cell Motility and Interaction Dynamics Imaged by Two-Photon Microscopy in Lymphoid Organs. Annu Rev Immunol.</a> Annu Rev Immunol. , (2008).</li>
<li>Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+imaging+of+lymphocyte+motility+and+antigen+response+in+intact+lymph+node%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node.</a> Science. 296, 1869-1873 (2002).</li>
<li>Van den Broeck, W., Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-19 (2006).</li>
<li>Cahalan, M. D., Parker, I., Wei, S. H., Miller, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-photon+tissue+imaging%3A+seeing+the+immune+system+in+a+fresh+light%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Two-photon tissue imaging: seeing the immune system in a fresh light.</a> Nat Rev Immunol. 2, 872-880 (2002).</li>
<li>Germain, R. N., Miller, M. J., Dustin, M. L., Nussenzweig, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+imaging+of+the+immune+system%3A+progress%2C+pitfalls+and+promise%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dynamic imaging of the immune system: progress, pitfalls and promise.</a> Nat Rev Immunol. 6, 497-507 (2006).</li>
</ol>

Bu video protokol evlatlık hücre transferi ve periferik lenf nodu görüntüleme lenfosit motilite için gerekli lenf nodu yalıtım ve hazırlık işlemleri göstermektedir. İki foton görüntüleme hem eksplante dokular (burada görüldüğü gibi) ve intravital hazırlıklarında konfokal görüntüleme üzerinde birçok avantajı vardır. Özellikle, infra-kırmızı uyarma ışık dağılımını en aza indiren ve lenf nodu kapsül altında görüntüleme ~ 300 mikrometre sağlar ve bazı dokularda 4 derin kullanın. Ayrıca, çoklu foton uyarma beyazlatma fotoğraf ve odak düzlemi yan dışarı doku hasarı en aza indirmek amacı odak noktasına sınırlıdır. Ancak, herhangi bir yeni bir teknik olduğu gibi, iki-foton görüntüleme, her derde deva değildir ve kendi sınırları ve potansiyel tuzaklar, akılda 5 tutulmalıdır. Bunlardan ilgi kollajen-hücreleri tarafından ikinci harmonik oluşumu gibi içsel sinyalleri dışında floresan ekstrensek probları veya floresan proteinlerle ifade etiketli olmalıdır gerekliliğidir. Izlenim bu etiketli hücreleri böylece siyah bir boşluk yüzme oluşturulur; gerçeği dalmış, ve yapı elemanları ve sayısız diğer etiketsiz, görünmez hücreleri karmaşık bir çevre ile etkileşim oysa. Immünoloji iki foton görüntüleme sunulmasından bu yana altı yıl içinde, bu tekniğin, uzun süredir bozulmadan yaşayan dokuların süreç, hücre-hücre etkileşimleri, hücre hareketi ve lokalizasyonu, hücresel sinyal yollar ve sitotoksik hücre de dahil olmak üzere doğrudan görselleştirme soruları yanıtlamak için araştırmacılar izin verdi olaylar öldürüyor. Alanında ilk fenomenolojik açıklamaları ötesinde hızla evrim geçirdi ve bilgisayar modelleme ve simülasyon ile birlikte kantitatif analizleri, lenf düğümleri içinde görünüşte kaotik hücresel hareketler ve etkileşimleri etkin bir immün yanıt yol nasıl mantıklı başlıyor. Bu ilerleme immunoimaging iki foton mikroskopi uygulama açıklayan 100 kağıtları listeleyen yeni bir yayın 1, kapsamlı bir gözden geçirilir.

farelerde periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-foton görüntüleme

Dissection and 2-Photon Imaging of Peripheral Lymph Nodes in Mice

İki foton görüntüleme bazal koşullar altında lenf nodu içinde ve bir immün yanıt 1 başlangıcında zarif bir koreografi motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkarmıştır. Burada, etiketli T hücreleri, lenf düğümleri izolasyonu, görüntüleme motilite ve CD4 + T hücreleri ilk kez 2002 2 açıklandığı gibi eksplante lenf nodu evlatlık transferi için yöntemler sunar. Bağışıklık hücrelerinin iki foton görüntüleme hücrelerinin bir hücre izci boya ile boyanarak floresan veya floresan proteini ifade ederek, ya etiketli olduğunu gerektirir. Biz bir alıcı hayvanın kuyruk ven, yaklaşık 15-30 dakika içinde lenfoid organlara evlerine içine donör farelerden elde edilen hücreler enjekte evlat edinen transfer prosedürü göstermektedir. Biz bir lenf nodu izolasyonu göstermek ve lenf düğümü eksize uygun montaj sağlamak için yöntemler tarif. Perfüze medya, sıcaklık ve lazer güç uygun oksijenasyon gibi diğer hususlar ele alınmıştır. Son olarak, naif CD4 3D video görüntüleri + T hücreleri mevcut 37 kararlı durum motilite sergileyen ° C

İki foton görüntüleme ve bir bağışıklık yanıtı 1 sırasında bazal koşullar altında lenf nodu içinde lenfosit motilite ve hücresel etkileşimleri ortaya çıkardı. Burada, T hücreleri, lenf düğümleri izolasyon ve görüntüleme motilite CD4 + T hücreleri eksplante lenf nodu evlatlık transferi göstermektedir.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

İki fotonlu görüntüleme, bazal koşullarda ve ... durumunda lenf düğümü içerisindeki hareketlilik ve hücresel etkileşimlerin zarif koreografisini ortaya çıkarmıştır.

Merhaba, benim adım Melanie Matthew. California Irvine Üniversitesi'ndeki Micah Helen'ın laboratuvarından geliyorum. Bugün, in situ iki foton görüntüleme amacıyla bir fareden lenf düğümlerini çıkaracağız.Bu işlem; inguinal lenf nodlarının, aksiller lenf nodlarının ve servikal lenf nodlarının çıkarılmasını kapsar. Fare lenf nodlarına floresan hücreleri aktarmak için, farede erişimi kolay olan altı periferik lenf nodu kullanılır. İki foton görüntüleme ile görüntüleme yapabilmek için öncelikle floresan işaretli hücrelerin adoptif transferini gerçekleştirmeliyiz.Bu deney için, öncelikle size adaptif transferi göstereceğim. İşte 28 gauge insülin şırıngamız. İçine bazı hücreler veya hücreler yükleyeceğim.Öncelikle, kolayca hareket edebilmesi için şırıngayı rahatlatmak istiyorum. Ardından hücreleri dikkatlice yükleyeceğim. İnsülin şırıngasının tüpün kenarlarına değmemesi için elimden geleni yapacağım; çünkü bu durum şırınganın ucunu köreltecek ve fare kuyruk venine enjeksiyon yapmayı zorlaştıracaktır.Eğer hava kabarcıkları varsa, bunları hafifçe vurarak dışarı çıkarmalı, yani engel teşkil etmeyecekleri bir yere taşımalısınız. Buraya hafifçe vurarak onları uzaklaştırın. İşte bu kadar.Şimdi bu hücreleri kuyruk venine enjekte etmeye hazırız. Tamam, işte C 57 black six faremiz. Fareyi yavaşça ve nazikçe kuyruk veni enjektörüne doğru yerleştireceğiz.Farelerin çoğu bundan hoşlanmaz, ancak bu işlem, gerçek enjeksiyonu yaparken zıplayıp kendilerine daha fazla zarar vermelerini veya sizin olası bir iğne batması yaşamanızı engeller. Bu nedenle fareyi içeriye çok yavaşça sabitleyin. Şimdi farenin kuyruğunun yanları boyunca kuyruk venini arayın.Üst boyunca büyük bir arter uzanır. Farenin kuyruğunun her iki yanında ise uç kısma kadar uzanan iki adet belirgin uzun ven bulunur.İğneyi alın, kuyruğun alt kısmından başlayın ve bir ven arayın. Tam şurada bir ven görebiliyorum. Burayı biraz etanol ile ıslatacağım, bu sayede venin görülmesi biraz daha kolaylaşabilir.Tamam, şimdi kuyruk venine enjeksiyon yapacağız ve iğnenin eğimli tarafının yukarıda tutulması önemlidir. Yani iğnenin açık ucu yukarıya bakmalıdır. Ayrıca, kuyruğa neredeyse paralel bir şekilde ilerleyin.Damarlar hemen üstte olduğu için bir açıyla girmek istemezsiniz. İğneyi kuyruk venine çok yavaşça kaydırmanız gerekir. Bunu yaparken, biraz daha deneyim kazandığınızda iğnenin içeri girdiğini hissedebilmelisiniz.Ancak ilk birkaç seferde sıvıyı itip herhangi bir direnç olup olmadığını görmek istersiniz. Direnç yoksa kuyruk venindesinizdir ve şu an yaptığım gibi hızlı ve kolay bir enjeksiyon yapabilirsiniz. Ardından iğneyi yavaşça dışarı çekebilirsiniz.Damarda olduğunuzun bir diğer kanıtı, geri akış nedeniyle küçük bir kan kabarcığının oluşmasıdır. Enjeksiyon bölgesinden az miktarda kan geri gelmesi, kesinlikle kuyruk veninde olduğunuzu onaylayacaktır. Enjeksiyondan kısa bir süre sonra farenin kanaması durmalıdır.Peki, işte siyah C57BL/6 faremiz. Fareyle ilgili olarak, şuralarda bulunan inguinal yan bölgelerden, koltuk altı kısmında bulunan aksiller düğümlerin olduğu şuradan ve diğer taraftan lenf düğümlerini çıkaracağız. Ardından, boğaz kısmında şurada ve şurada olan, her iki tarafta birer tane bulunan yüzeysel servikal düğümleri çıkaracağız.Merhaba. Artık faremizi dissekt etmeye hazırız. İlk olarak fareyi buradaki diseksiyon tahtasına iğneleyerek başlayacağım. Şimdi fareyi iğneleyelim. Evet.Sabitleme işleminin güvenli olduğundan emin olmalısınız. Bu, periferik lenf düğümlerini daha iyi açığa çıkarmamıza olanak tanıyacaktır. Bu nedenle genellikle dört patinin tamamını sabitlerim.Kuyrukla ilgili endişelenmiyorum. Bazı kişiler kuyruğu da iğnelemeyi tercih eder. Ardından, kürkün diseksiyon yaptığımız bölgeye girmesini, lenf düğümlerimizin ve aletlerimizin üzerine yayılmasını önlemek için fareye %70 etanol püskürtüyoruz.Farenin etanol ile uyuşturulmuş olmasıyla birlikte, orta hatta bir insizyon yapacağım. Bunu, tüyleri vücuttan uzaklaştırarak gerçekleştiriyorum. Gördüğünüz gibi deri kısmını yukarı çekerek küçük bir çadır oluşturabiliyorum.Bu sayede, bu durumda yapmamanız gereken bir işlem olan peritonu kesmekten kaçınmış olursunuz. Tamam, şimdi buradan orta hat insizyonuma başlayacağım. Küçük bir kesi yapıyorum ve peritona girmediğimden emin oluyorum.Alt tarafta peritonun olduğunu görebilirsiniz. Makası kesinin altına yerleştiriyorum ve cildi peritondan ayırmak için yavaşça ilerliyorum; servikal lenf nodlarını alacağımız için ilerledikçe küçük kesiler yapıyorum. Herhangi bir ana kan damarına zarar vermediğimden emin olarak, çok dikkatli ve yavaş bir şekilde farenin çene hattına kadar kesiyorum.Ardından, deri flebinin alt kısmında bulunan inguinal lenf nodlarını alacağımız için, orta hattan kuyruğa, tam olarak kuyruk tabanına kadar bir insizyon yapacağım. İşte böyle. Bizim için uygun olacak bir orta hat insizyonu gerçekleştirdik.Şimdi deriyi peritondan ayıracağım. Bunu, ilerledikçe deriyi peritondan uzaklaştırarak forsepsle nazikçe yapacağım. Ve diseke edeceğimiz ilk lenf nodunu açığa çıkarıyorum.Burada, alt deri flebinin içinde bulunan inguinal lenf nodu görülmektedir. Fare gövdesinden bir deri flebi kaldırdıktan sonra, inguinal lenf nodunu açığa çıkarmak için bunu iğneyle sabitleyeceğim. Böylece inguinal lenf nodu daha iyi bir şekilde görünür hale gelir ve bu da onu temiz bir şekilde diseke etmemize olanak tanır.Burada, iğneleme sonrası açığa çıkarılmış inguinal lenf nodunu görüyoruz. Tipik olarak, hemen bacağın üstündeki deri flebi içinde bulunur. Üzerinden geçen kan damarlarının Y şeklindeki birleşim noktasına bakarak burayı bulabilirsiniz.İşte burada. Az miktarda yağ dokusuyla çevrelenmiş ve üzerinde kan damarları seyrediyor. Tamam, şimdi inguinal lenf nodunu çıkaracağım.Lenf nodunu yağdan ayırmak için pensimi her iki yan boyunca kaydırıyorum. Hiç yağ istemiyoruz. İki foton görüntülememizde, yağ dokunun lazer penetrasyonunu engelleyecektir.Bakalım. Lenf düğümü için tüm yağ dokusunu ayırmak ve aynı zamanda lenf düğümünün korteksini sağlam tutmak önemlidir. Tamamdır, işte oldu.İşte burada ileak lenf nodumuz var. Bunu besiyerine yerleştireceğim; tüm yağların temizlenip temizlenmediğini anlamanın en iyi yolu lenf nodunun batıp batmadığına bakmaktır. Besiyerine yerleştirdiğinizde, doğrudan dibe çökecektir.Eğer herhangi bir yağ varsa, yüzeye çıkacaktır. Pekala, şimdi yardımcı lenf düğümünü çıkaracağım. Bu düğüm, farenin koltuk altında, ana bir kan damarının hemen boyunca yer alır.Bu nedenle bazen durum zorlaşabilir çünkü lenf nodunun görünürlüğünü engelleyen yoğun bir kanama meydana gelebilir. Ancak size nasıl yaptığımı göstereceğim ve umuyorum ki bu sefer herhangi bir kanama olmayacak. Öncelikle cilt flebini kaldırıyorum ve aslında almak istediğim nodun yanındaki bu ön kol bölgesini açıyorum.Bu, parmaklarımı kullanarak deriyi daha çevik bir şekilde çekmemi sağlar; koltuk altından geçen bu kası tuttuğumda, hafifçe çekmekle bir aksiller lenf nodu dışarı çıkacaktır. Şimdi onu arıyorum. Ve işte burada.Tam orada, koltuk altında, ana bir kan damarı boyunca yer alıyor. Şimdi aksiller nodu diseke edeceğim; deriyi tekrar iğneleyebilir veya parmaklarınızla tutabilirsiniz, hangisi sizin için daha rahatsa onu yapın. Ancak ben burada dikkatli çalışmayı tercih ediyorum.Bu lenf düğümünün çevresinde çok az yağ vardır, bu da onu görüntüleme için uygun hale getirir; ancak ana bir kan damarının yanında yer aldığı için dikkatli olmazsanız bazen onları kaybedebilirsiniz. Bu nedenle aksiller düğüm için çevresindeki bağ dokusunu kavrıyorum ve yavaşça kan damarlarından ayırıyorum. Ve tamam, işte oldu.İşte aksiller lenf nodumuz. Tam orada. Oldukça uzun ve yassı bir lenf nodu.Düğümün kendisine zarar vermemek için, düğümün yan tarafında kalan bağ dokusundan küçük bir parçayı tutuyorum. Lenf düğümlerinin hidrasyonunu korumak için görüntüleme yapacağız. Kurum içi görüntülememizi yapmadan önce, inguinal, aksiller ve servikal lenf düğümlerini takip edebilmek için onları ayrı bölmelerdeki CO2 bağımsız besiyerlerine yerleştiriyoruz.İyi bir lenf nodu hazırlığı yapıp yapmadığınızı, nodu diseke ettikten sonra dibe çöküp çökmeyeceğinden anlayabilirsiniz. Bu, lenf nodunda çok az yağ olduğu anlamına gelir. Tamam, şimdi servikal lenf nodunu, yani yüzeysel servikal lenf nodunu çıkaracağım.Ve bunu yaparken, aksiller lenf düğümünü çıkardığım zamanki gibi yeniden iğneleyerek başlarım, böylece servikal dokuyu biraz daha iyi açığa çıkarırım. Servikal lenf düğümleri farenin çene kaslarının yakınında, aslında yan taraf boyunca yer alır.Bunlar, hastalandığınızda hissedebildiğiniz lenf düğümlerinin aynısıdır. Bunlar, soğuk algınlığı yaşadığınızda doktorunuzun kontrol edeceği düğümlerdir. Bunu yapmak için, forsepsimi yan boyunca kaydırırken dokuyu öne doğru çekmek amacıyla genellikle parmağımı dokunun altına yerleştirmeyi tercih ederim.Dışarı çıkan bir lenf nodum olmalı. Ah, işte orada. Dokunun üst kısmında.İşte burada. Burada yüzeyel servikal lenf nodu mevcut. Tükürük bezlerini almamaya dikkat etmelisiniz.Tükürük bezlerinizde hiç T hücresi bulamazsınız. Ancak bu özel lenf düğümleri, içinde CFSC ile işaretlenmiş CD4 pozitif T hücreleri barındırır. Bu nedenle, size bu T hücrelerinin doku içindeki hareketlerini gösteren bazı in situ videolar izleteceğiz.Şimdi, lenf nodunu in situ görüntüleme platformumuzun tabanına sabitleyebilmemiz için kırılmaz plastik bir lamel üzerine yapıştıracağım. Böylece T-hücrelerini görüntülerken doku hareketini veya doku kaymasını önlemiş olacağız. Burada kırılmaz plastik lamellerim mevcut.İlk olarak, bunlardan birini lenf düğümümüz için uygun boyuta getireceğim. Makasımı alıyorum ve buradan küçük bir kare kesiyorum. Tamam, şimdi üzerine biraz yapıştırıcı süreceğim.Az miktarda yapıştırıcı kullanıyoruz. Bunu kestiğimiz lam parçasına yayıyoruz. Ardından, bir kim wipe ile fazla yapıştırıcıyı çekiyorum.Bu, nodu kaplayacak olan yapıştırıcıdır. Görüntülemeyi engellememesi için sadece çok ince bir tabaka istiyoruz. Şimdi çözeltiden bir lenf nodu çıkaracağım.Şimdi, ortamdan çıkardığımız ilk lenf nodu ile başlayacağız. Buna nazik davranmalısınız; nodun korteksine zarar vermemelisiniz.Sadece köşesinden tutup, önce lenf düğümünün köşesini nazikçe lama dokundurarak ve ardından lenf düğümünü lam üzerinde çekerek lama sabitleyeceğim ve yapıştıracağım. Bunu yapmak için lenf düğümünün kenarında kalan şu küçük yağ parçasını kullandım. Böylece düğümün korteksine aslında zarar vermemiş oluyorum.Ardından lenf nodunu alıyorum ve şimdi yapıştırıcıyı kürlemek için, onu çıkardığım aynı kuyucuğa daldıracağım. Bu yüzden onu ters çevirip tüm yapıştırıcıyı taşıyan medyumun içine nazikçe daldırıyorum. Bununla birlikte kürlenen exo glue'dan bir miktar alıyorum.İşte bu kadar. Artık iki foton görüntüleme için hazırlanmış bir lenf düğümüne sahibiz. Lenf düğümleri in situ iki foton görüntüleme için bu şekilde hazırlanır.Şimdi örnekleri mikroskobumuza götüreceğiz, kurulumu yapacağız ve adoptif olarak transfer ettiğimiz T hücrelerinin harika görüntülerini elde edeceğiz. Burada, bir inguinal lenf nodu içerisinde hareket eden CFSE ile işaretlenmiş T hücrelerini görüyoruz. Bu video yaklaşık 500 kat hızlandırılmıştır ve hücrelerin oldukça hareketli olduğunu görebilirsiniz.Bunlar, 20 x su daldırmalı objektifimizle yaklaşık 20 x büyütülmüştür. Bu sadece T hücresi hareketine dair bir örnektir. Çevredeki hücreleri boyamak için herhangi bir işlem yapmadık.Genellikle daha gelişmiş iki foton deneylerinde; boyanmış dendritik hücreler, boyanmış B hücreleri ve boyanmış NK hücreleri ile etkileşime giren T hücrelerine sahip olabilirsiniz. Lenf düğümü içinde görmeyi beklediğiniz hemen hemen her hücre tipini etiketleyebilir ve görüntüleyebilirsiniz. Kurumumuzun lenf düğümü görüntüleme protokolü için anlatacaklarımız bu kadar.

dissection-and-2-photon-imaging-of-peripheral-lymph-nodes-in-mice

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Yenidoğan kimeralar üretimi yanı sıra 2-Foton Mikroskopi diseksiyonu ve ex vivo görüntüleme için timus hazırlanması için adım adım talimatlar sunuyoruz.

2-Foton Mikroskop kullanarak Fare Thymus in situ Görüntüleme

Bu protokol, lenf nodu dilimler halinde sunulan görüntü floresan T hücreleri için bir yöntem açıklanır. Bu teknik, geleneksel widefield floresan veya konfokal mikroskoplar ile T hücre göç gerçek zamanlı analiz izin verir.

Widefield ve Konfokal Mikroskoplar murin Lenf Düğümü Dilimleri T Hücre ex vivo Görüntüleme

Biz roman laboratuar araçları ve timus intravital görüntü elde etmek için protokoller geliştirdik. Bizim tekniği T hücre gelişimi oluşur timus içinde "nişler" belirlenmesinde yardımcı olacaktır.

2-Foton Mikroskopi kullanarak Fare Thymus intravital Görüntüleme

2-foton mikroskopi son gelişmeler, gerçek zamanlı...

Intravital Görüntüleme Fare Popliteal Lenf Nodu

Yakın kızılötesi floresans (NIRF) kullanarak en son geliştirilen görüntüleme teknikleri lenfatik sistem kanseri metastazı oynadığı rol, immün yanıt, yara onarımı ve diğer lenfatik ilişkili hastalıkların ortaya çıkmasına yardımcı olabilir.

Bir Mouse Lenfatik damarları Non-invaziv Optik Görüntüleme

Bu videoda, farenin arka bacaklarından popliteal drenaj lenf düğümlerini toplamak için bir diseksiyon tekniği gösterilmektedir. Lenf düğümleri, doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık arasında köprü kurmada kritik bir rol oynar ve korunmuş bir doku yapısı ve hücresel canlılık ile sağlam lenf düğümlerinin toplanması, lokal ve sistemik bağışıklık tepkilerinin incelenmesine yardımcı olabilir.

Ex Vivo Görüntüleme için Murin Popliteal Drenaj Lenf Nodlarının Çıkarılması İçin Bir Diseksiyon Yöntemi

Yetişkin farelerin lenf düğümlerinde 120 um derinliğe kadar kontrastlı sahip yüksek-çözünürlüklü intravital görüntüleme uzamsal bir multi-odak iki foton mikroskop uyarım modelini modüle edilmesi ile elde edilir. 100 mikron derinliğinde biz böylece saçılma ve difraksiyon sınırlarını engellemeyi, 487 nm çözünürlük (lateral) ve 551 nm (eksenel) ölçüldü.

Germinal Merkezleri derece Çözülmüş Intravital Çizgili-aydınlatma Mikroskopi

Bu protokol, organ yapısında değişiklik olmadan lenf düğümlerini boşaltmada farklı hücre popülasyonlarını görüntüleyen bir tekniği tanımlar.

Ex-Vivo Konfokal Mikroskopi ile Lenf Nodal Yapısı nın Ve Hücresel Lokalizasyonun Görselleştirilmesi

Bir protokol hafif levha floresan mikroskobu ile doku temizleme birleştirerek sunulmaktadır (LSFM) lenfatik damarlar ve lenf düğümleri üç boyutlu ve hücresel çözünürlük görüntüleri elde etmek için (LNs) beyin omurilik sıvısı toplama (BOS) ve spinal epidural sıvı.

IDISCO+ ve Hafif Sac Floresan Mikroskobu ile Vertebral Lenfatik Vaskülatür ve Drenajın Üç Boyutlu Görüntülemesi

El yazması, servikal lenfatik damarların (cLV) çeşitli fizyolojik fonksiyonlarını ve beyin drenajı ile klirens mekanizmalarının modülasyonuna yönelik terapötik stratejileri test etmek için farelerde servikal lenfatik damarların ve lenf akışının in vivo çalışması için yenilikçi bir yöntem sunmaktadır.

Farelerde Servikal Lenfatik Damarların Kasılması ve Lenf Akışının In vivo İki Foton Görüntülemesi için Tekrarlanabilir Kurulum

Burada, birden fazla nörolojik hastalıkta önemli rol oynayan fare meningeal lenfatik damarlarının (MLV) değerlendirilmesi için bir protokol sunulmaktadır. Bu protokolün amacı, hem izleyici drenajının işlevsel değerlendirmesini hem de dorsal MLV ağının ayrıntılı morfolojik karakterizasyonunu mümkün kılan entegre bir yöntem sağlamaktır.

Meningeal Lenfatiklerin Değerlendirilmesi İçin Entegre Protokol: Cisterna Magna enjeksiyonu, Lenf Düğümleri Görüntüleme, Meningeal Diseksiyon ve Bütün-Montaj Boyama

Öğrenin, farelerde periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-foton görüntüleme yöntemini. CD4+ T hücre hareketliliğini in vivo görselleştirerek immünolojik araştırmalarda kullanın.

Farelerde Periferik lenf nodu diseksiyonu ve 2-Foton Görüntüleme

Daha fazla video keşfet