Name: Lazer Uncagable Floresein Dextranın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-28T17:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Öğrenin, zebra balığı embriyolarında UV lazer ile kafesli fluoressein aktivasyonu kullanarak hücre soy hattı etiketleme yöntemini. Bu teknik, immünofloresan mikroskopi ile hücre kaderini izlemeyi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz Dan Carlin kafesli floresein yapımında yardım için teşekkür etmek istiyorum. Buna ek olarak aşağıdaki finansman kaynakları teşekkür etmek istiyorum: JAC Gelişimsel Biyoloji Eğitimi Hibe Vanderbilt Üniversitesi Tıp Fakültesi Program ve NIH HD054534to JTG.

1. Kafesli Floresein Dextran'ın Sentezi <ol><li> 3.5 Tedbir - aminodextran 4 mg ve 1 mg CMNB-kafesli floresein GD içeren Invitrogen sağlanan renkli bir tüp içine ekleyin. Bizim ellerde bu oran ortalama bir yükleme ~ dekstran ortalama 2.5 boya molekülleri verir. </li><li> Tüp 0,1 M Na 2 B 4 O 7 (sodyum borat) tampon 500 mcL ekleyin. </li><li> Cap ve aminodextran ve kafesli floresein çözmek için 30 saniye karıştırın. </li><li> Vorteks karıştırıcı gecede tepki olsun. </li><li> Zeba spin kolon alt kapatma Twist ve kapağı gevşetin. Bir keçeli kalem ile sütun üzerinde bir nokta işaretleyin. 15 ml konik tüp yerleştirin sütun. </li><li> Rotor merkezi karşılaştığı nokta ile 2 dakika süreyle 1000 xg'de santrifüjleyin. Hemen sıkıştırma sonra sütunu kullanın. </li><li> Yeni bir 15-ml konik tüp sıkıştırılmış sütunu yerleştirin. </li><li> Havuzu reaksiyon karışımı ve sıkıştırılmış sütun reçine yatak merkezine transfer. Kapağını takın. </li><li> Rotor merkezi karşılaştığı nokta ile 2 dakika süreyle 1000 xg'de santrifüjleyin. Spin sonra Eluent ve sütunun üst kabaca aynı renk sarı gölge olacaktır. </li><li> Sarı Eluent (~ 350 mcL) 1.5 mL mikrosantrifüj tüpüne aktarın. </li><li> Bir speedvac kuruluk Lyophilize. Speedvac folyo ile örtün. </li><li> % 1 w / v nihai konsantrasyonu, su, soluk sarı köpük, yeniden askıya çıkan ~ 2-3 mg </li><li> Bu çözüm folyo kaplı tüplerde -20 ° C'de saklayın. Bu kısım tekrarlayan donma-çözülme önlemek için dekstran çözüm iyi bir fikirdir. </li></ol> 2. Zebra balığı Embriyolar içine Kafesli Floresein Dextran'ın Enjeksiyon <ol><li> 0,2 M KCl kafesli floresein dekstran 1:5 veya 1:10% 1 w / v hisse senedi sulandırınız. </li><li> 0.5 enjekte basıncı enjektör kullanarak bir hücre dönem embriyoların yumurta sarısı içine kafesli floresein çözüm, 1.0nL. Bir kez enjekte edilen embriyolar, kavramalar ° C, non-spesifik uncaging azaltmak için 28.5 karanlıkta muhafaza edilmelidir. </li><li> El embriyolardan chorions çıkarın. </li><li> 4% tricaine embriyolar anestezisi. </li><li> Embriyolar 35mmx10mm petri sonra yumurta su ile kaplı,% 0.8 agaroz monte olacak. </li><li> En az 15 dakika süreyle 50 ° C ısı bloğu içinde erimiş agaroz dengelenmesi. </li><li> Cam bir pipet kullanarak, az miktarda su, tek bir embriyo çizmek ve agaroz Not içine bırakın. Önlemek için embriyo tüp içine koyarak, yaklaşık 30 saniye önce elinizde agaroz tüp soğutmak için önemlidir . embriyonun öldürülmesi. </li><li> Agaroz, yaklaşık 50μL ile birlikte, embriyo tüp Pipet ve petri merkezi üzerine içeriğini çıkarmak. </li><li> Hızla şark yukarı bakacak Uncaged hücreleri ile plastik bir iş parçacığı kullanarak embriyo Not: serin hızlı embriyo yönlendirilmesi ile acele agaroz. Agaroz katı olduktan sonra manipüle eğer Embriyolar zarar görebilir. </li><li> Agaroz tamamen katılaşmaya (bu birkaç dakika sürer) ve% 4 ve% 0.003 tricaine PTU içeren yumurta su ile dolu çanak üçte ikisi doldurmak için izin verin. </li></ol> 3. Lazer Uncaging Floresein Dextran'ın <ol><li> Uncaging için kullanılan mikroskop, 40X suya daldırma hedefi sahip olması gerekir. </li><li> Biz, 365 nm boya hücre ve% 70 /% 30 split dikroik ayna ile bir Fotonik Instruments lazer kullanır. </li><li> Önce uncaging, lazer, objektif ve uygun güç için zayıflatılmış parfocal yapılmalıdır. </li><li> Lazer odaklanmak için, aynalı cam slayt hedefi altında bir yerde ve slayt çizikler görülebilir kadar objektif odak. </li><li> Lazer, tek bir darbe ile ayna açıkça görünür bir çizik üretebilecek hale gelene kadar lazer zayıflatıcı ayarlayın. </li><li> Objektif odak yukarı ve aşağı doğru ayarlayın. Objektif odak dışında olduğunda lazer bir çizik üretebilir, lazer odağı ayarlamak ¼ açmak veya aşağı yukarı. Lazer ayna sadece amaç odaklı çizebilir kadar tekrarlayın. </li><li> Place Uncaged alan amaç ve odak altında embriyo monte edilebilir. </li><li> Uncage için, bir hücre ilgi odağı ve 2-3 Hz'de 10-20 kez darbe. </li><li> Forseps ile agaroz soyma ve yumurta su koyarak% 0.003 PTU içeren uncaging sonra, embriyo. Sabit oluncaya kadar embriyolar bir ışık geçirmez kutu gelişir. </li></ol> 4. Antikor Etiketleme ve Uncaged Floresein Dextran'ın Algılama <ol><li> Ab fiksatif embriyolar Fix 4 2-4 saat oda sıcaklığında (RT) ya da gecelik (O / N) ° C (% 4 paraformaldehid, 0.3mm CaCl 2,% 8 sakaroz, 1X Fosfat Tuzlu, pH 7,3 Tamponlu ) Etiketleme tüm adımlar için, ışık geçirmez bir kutu veya folyo sarılmış tüp embriyolar tutun. </li><li> Fiksatif çıkarın ve% 100 MeOH ile değiştirin, oda sıcaklığında 10 dakika bekletin, MeOH ve Repla kaldırmak% 100 taze MeOH ile ce. </li><li> -20 ° C'de en az 30 dakika süreyle MeOH Mağaza Not: epitoplar düşmeye başlamadan önce, iki hafta kadar için MeOH saklayabilirsiniz . </li><li> % 75 MeOH/1X Fosfat RT 5 dakika yıkar embriyo rehidrate tamponlu tuzlu su ile% 0.1 Tween 20 (1X PBSTw), daha sonra% 50% MeOH/50 1XPBTw, daha sonra% 25 MeOH/75% 1X PBSTw. </li><li> 1XPBSTw 5 dakika için üç kez yıkayın. </li><li> Eğer embriyolar&gt; 24 saat, 10 mikrogram / mL proteinaz K 1XPBSTw embriyo permiabilize. Permiabilization zaman sahnede bağlıdır. Embriyolar, 24 ve 48 saat sonrası fertilizasyon (hpf) arasında olup olmadığını proteinaz K Beş dakika yeterlidir. Eğer eski larvaları için daha fazla zaman gerekebilir. RT 20 dakika Ab fiksatif Re-fix </li><li> RT 1XPBSTw 5 dakika süreyle beş kez yıkayın. </li><li> Oda sıcaklığında 1-2 saat (1XPBS,% 0.1 Triton x100,% 10 koyunu serum,% 10 Bovine serum albümin,% 1 Dimetil sülfoksit) blok çözüm inkübe edin. </li><li> Çözümü engelleme primer antikorları (anti-floresein artı hücre türüne özgü belirteçler karşı antikorlar) sulandırınız. </li><li> 4 inkübe embriyolar O / N ° C primer antikorları içeren bir çözüm. </li><li> 1XPhosphate 20 dakika boyunca dört kez yıkayın RT% 0,1 Triton x100 (PBSTx) Tuzlu Tamponlu. </li><li> Çözümü engelleme floresan etiketli sekonder antikor (genellikle 1:300) sulandırınız. </li><li> 4 inkübe O / N ° C sekonder antikorlar içeren bir çözüm. </li><li> RT 1XPBSTx 20 dakika boyunca dört kez yıkayın. </li><li> RT en az iki saat için 50% glycerol/50% 1XPBS net embriyolar, daha sonra kaldırmak gliserol / PBS karışımı ve% 100 gliserol ekleyin ve bekletin 4 O / N ° C </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Immunolabeling sonra, (Şekil.1) Uncaged hücrelerinde boyanma zengin bir alan olmalıdır. Floresein spontan uncaging nedeniyle, nispeten yüksek bir sinyal gürültü oranı&gt; 48 saat eski Zebra balığı görmek için alışılmadık bir durum değildir. <img src="/files/ftp_upload/2672/2672fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 zebrafish epifiz kompleks Lineage etiketleme. Hpf foxd3 tarafından belirtilen ön epifiz anlage bir kısmı, 24 yaşında GFP ifade, UV lazer darbeleri kullanarak Uncaged A) 48hpf olarak, hücrelerin sol taraflı bir küme parapineal (kırmızı daire) Uncaged ortaya çıkmıştır etki alanı (beyaz daire). B), parapineal (kırmızı daire içinde Uncaged floresein sinyali zenginleştirilmiş) ve pineal organ (beyaz daire) .

<ol><li>Hatada, Y., Stern, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fate+map+of+the+epiblast+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A fate map of the epiblast of the early chick embryo.</a> Development. 120, 2879-2889 (1994).</li>
<li>Moody, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fates+of+the+blastomeres+of+the+32-cell-stage+Xenopus+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fates of the blastomeres of the 32-cell-stage Xenopus embryo.</a> Dev Biol. 122, 300-319 (1987).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multipotent+Precursors+Can+Give+Rise+to+All+Major+Cell-Types+of+the+Frog+Retina%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Multipotent Precursors Can Give Rise to All Major Cell-Types of the Frog Retina.</a> Science. 239, 1142-1145 (1988).</li>
<li>Wetts, R., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+fluorescent+tracers+to+study+neural+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Microinjection of fluorescent tracers to study neural cell lineages.</a> Development. , Suppl 2. 1-8 (1991).</li>
<li>Woo, K., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Order+and+coherence+in+the+fate+map+of+the+zebrafish+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Order and coherence in the fate map of the zebrafish nervous system.</a> Development. 121, 2595-2609 (1995).</li>
<li>Ando, R., Hama, H., Yamamoto-Hino, M., Mizuno, H., Miyawaki, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optical+marker+based+on+the+UV-induced+green-to-red+photoconversion+of+a+fluorescent+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">An optical marker based on the UV-induced green-to-red photoconversion of a fluorescent protein.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 12651-12656 (2002).</li>
<li>Sato, T., Takahoko, M., Okamoto, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HuC%3AKaede%2C+a+useful+tool+to+label+neural+morphologies+in+networks+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">HuC:Kaede, a useful tool to label neural morphologies in networks in vivo.</a> Genesis. 44, 136-142 (2006).</li>
<li>Wiedenmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EosFP%2C+a+fluorescent+marker+protein+with+UV-inducible+green-to-red+fluorescence+conversion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">EosFP, a fluorescent marker protein with UV-inducible green-to-red fluorescence conversion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 15905-15910 (2004).</li>
<li>Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHaugland%2C+RP+%22Handbook+of+Fluorescent+Probes+and+Research+Chemicals%22">Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals</a>. , 9th Edition, 707-711 (2002).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Murakami, T., Ho, R. K., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+cell+movement+and+tissue+patterning+in+the+zebrafish+embryo+revealed+by+fate+mapping+with+caged+fluorescein%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regional cell movement and tissue patterning in the zebrafish embryo revealed by fate mapping with caged fluorescein.</a> Biochem Cell Biol. 75, 551-562 (1997).</li>
<li>Kozlowski, D. J., Weinberg, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoactivatable+%28caged%29+fluorescein+as+a+cell+tracer+for+fate+mapping+in+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Photoactivatable (caged) fluorescein as a cell tracer for fate mapping in the zebrafish embryo.</a> Methods Mol Biol. 135, 349-355 (2000).</li>
<li>Russek-Blum, N., Nabel-Rosen, H., Levkowitz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+fate+map+of+the+zebrafish+diencephalon%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">High resolution fate map of the zebrafish diencephalon.</a> Dev Dyn. 238, 1827-1835 (2009).</li>
<li>Summers, R. G., Piston, D. W., Harris, K. M., Morrill, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientation+of+first+cleavage+in+the+sea+urchin+embryo%2C+Lytechinus+variegatus%2C+does+not+specify+the+axes+of+bilateral+symmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The orientation of first cleavage in the sea urchin embryo, Lytechinus variegatus, does not specify the axes of bilateral symmetry.</a> Dev Biol. 175, 177-183 (1996).</li>
</ol>

Açıklandığı gibi, bu protokol, mikroenjeksiyon, mikroskopi ve immünofloresan sık kullanılan teknikler üzerine inşa edilmiştir zebrafish nispeten hızlı bir soy etiketleme yöntemi sağlar. Biz lazer yerelleştirilmiş bir moda flöresein uncage için en verimli ve maliyet etkin yolu olarak uncaging olduğunu bulduk. Bu yöntem 4 dpf&#39;e gibi geç olarak deneysel uç noktaları ile soy etiket olabilir. Ancak, hücre bölünmeleri gibi, hücre başına kafesli-floresein toplama sonunda saptanabilir düzeylerde ötesinde azalır. Buna ek ola...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/details.php?id=2672">Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran</a>. There was an error in the authors, Ilya A. Shestopalov and James K. Chen, names. The author's names have been corrected to: Ilya A. Shestopalov and James K. Chen instead of: Ilya Shestopalov and James Chen

A correction to the article Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran was made.

Erratum: Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

<table><tbody><tr><td>CMNB-kafesli flurorescein SE</td><td>Invitrogen</td><td>C20050</td><td></td></tr><tr><td>Aminodextran, 10kDa</td><td>Invitrogen</td><td>D1860</td><td></td></tr><tr><td>Zeba tuzsuzlaştırma spin kolonları</td><td>Pierce, Thermo Scientific</td><td>89889</td><td></td></tr><tr><td>keçi anti-flurorescein antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A11095</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 633 eşek anti-keçi antikoru</td><td>Invitrogen</td><td>A21082</td><td></td></tr><tr><td>35mmx10mm petri kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>351008</td><td></td></tr><tr><td>40x su daldırma objektifli dik bileşik mikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DM6000B</td><td></td></tr><tr><td>MicroPoint Manuel Lazer Aydınlatma Sistemi</td><td>Photonic Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Feniltiyüre (PTU)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06690</td><td></td></tr><tr><td>Trikain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E10521</td><td></td></tr><tr><td>Proteinaz K</td><td>Roche Group</td><td>03115836991</td><td></td></tr><tr><td>Plastik ip</td><td>Herhangi bir tedarikçi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agaroz</td><td>Research Products International Corp.</td><td>A20090</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>Savant SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Vorteks karıştırıcı</td><td>VWR international</td><td>Vortex Genie 2</td><td></td></tr><tr><td>Basınçlı enjektör</td><td>Applied Scientific Instrumentation</td><td>MPPI-3</td><td></td></tr></tbody></table>

lazer uncagable floresein dextran&#39;ın zebra balığı hücre lineage etiketleme

Lineage Labeling of Zebrafish Cells with Laser Uncagable Fluorescein Dextran

Gelişimsel biyoloji merkezi bir sorun farklılaşmamış öncüleri olarak ortaya çıkan omurgalıların bulunan sayısız hücre tiplerinin kökenini anlamak için. Araştırmacılar DII etiketleme 1 ve model sistemler geliştirme sonraki aşamalarında tespit hücre kaderinin izlenebilir enzimlerin basınçlı enjeksiyon 2 gibi soy etiketleme çeşitli yöntemleri, istihdam var. Zebra balığı (Danio rerio) ilk kaderi haritalar rodamin dekstran gibi floresan boyalar, iyontoforez enjeksiyon yoluyla embriyo ayrık bölgelerinde tek hücrelerin içine monte edilmiş ve üzerinden etiketli hücrenin kaderini izleme süresi 3-5. Etkili olsa da, bu yöntemlerin teknik olarak zor ve yaygın zebrafish laboratuarları bulunan olmayan özel ekipman gerektirmez. Son zamanlarda, ultraviyole ışığa maruz kaldığında yeşil kırmızı floresan geri dönüşümsüz geçiş Eos ve Kaede photoconvertable floresan proteinleri, zebrafish 6-8 artış görüyoruz. Zebrafish embriyo ve transgenesis göreli kolaylığı optik netlik soy etiketlenmesi için bu özellikle çekici araçlar yapmış ve in vivo 7 hücrelerin göç gözlemlemek için. Onların yardımcı programı olmasına rağmen, bu proteinlerin, boya-aracılı soy etiketleme yöntemleri, bazı dezavantajları karşılaştırıldığında var. En önemli zorluk biz Fotoçevrim sırasında bu proteinlerin 3 boyutlu yüksek çözünürlük elde bulduk. Bu ışık, belki de çözünürlüğü ve kullanım kolaylığı zebrafish soy etiketleme için en iyi kombinasyonu kafesli floresein dekstran kullanımı, su verme grubuna bağlı bir floresan boya yapar, maskeler, floresan 9 . Sonra boya, floresan veya İmmuno görselleştirme sağlayan bir lazer veya cıva lambası, UV ışık kullanarak belirli bir hücre içinde (su verme grubu serbest) &quot;Uncaged&quot; olabilir. Iyontoforez yöntemlerinin aksine, kafesli floresein standart enjeksiyon aparatları ile enjekte edilir ve bir iğne deliği 10 ile donatılmış bir Epifloresans mikroskop ile Uncaged. Buna ek olarak, floresein karşı antikor sadece Uncaged formu tespit ve epitop fiksasyonu iyi 11 hayatta. Son olarak, kafesli floresein iki foton mikroskopi 12,13 istihdam, özellikle çok yüksek 3-D çözünürlük ile aktive olabilir. Bu protokol, kafesli floresein ve lazer uncaging soy etiketleme bir yöntem açıklanır. Subsequenctly, Uncaged floresein antikorlar ile etiketleme gibi GFP gibi diğer epitopları ile eş zamanlı olarak algılanır.

Bu protokol, Uncaged floresein gelen sinyali yükseltmek için immunolabeling tüm montaj takip kafesli flöresein UV uncaging kullanarak hücrelerin zebrafish embriyoların küçük gruplar kaderi etiket ve takip etmek için bir yol çizer.

Lazer Uncagable Floresein Dextran&#39;ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

Gelişimsel biyolojideki temel problemlerden biri, omurgalılarda bulunan sayısız hücre tipinin, farklılaşmamış hücrelerden ortaya çıkarken nasıl meydana geldiğini çözümlemektir...

Bu prosedürün genel amacı, bir zebra balığı embriyosundaki hücreleri soy hattı boyunca etiketlemektir. Bu işlem, öncelikle kafesli floresein sentezleyip bunu zebra balığı embriyolarına enjekte ederek gerçekleştirilir. Ardından, etiketlenecek hücrelerin erişilebilir olması için embriyolar agarosa monte edilir.Ardından, embriyonun seçili hücrelerindeki kafeslenmiş floreseinle aktive etmek için bir UV lazer kullanılır. Son olarak, embriyolar istenen aşamaya kadar geliştiklerinde toplanır ve işaretli hücreler, belirli soy hatlarının belirteçlerine göre tespit edilir. Nihayetinde, foto-çözümleme ve immunofloresan mikroskopi aracılığıyla embriyolardaki seçili hücrelerin kaderini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu tekniğin Cade'in fotokonversiyonu gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, çok renkli immünofloresansın diğer hücre tipi spesifik antikorların yanı sıra kafes dışına çıkarılmış (uncaged) floreseinle tespit yapabilmesidir. Zebrafish embriyolarına kafesli (caged) floresein dekstran enjekte etmek için, önce bunu sentezleyin ve %1 ağırlık/hacim oranında hazırlayın. Stok alikotlarını beraberindeki yazılı protokole göre hazırlayın.Ardından, 0.2 molar potasyum klorür içinde bire beş veya bire 10 oranında seyrelten aliquot hazırlanır. Daha sonra, tek hücre aşamasındaki embriyoların vitellusu içerisine 0.5 ile 1 nanolitre arasında kafeslenmiş fluorescein çözeltisi enjekte edilir. Basınçlı enjektör kullanılarak enjeksiyon yapıldıktan sonra, istenen gelişim aşamasında spesifik olmayan kafes açılmasını azaltmak için embriyo grupları 28.5 °C'de karanlıkta tutulmalıdır.Koronu embriyolardan manuel olarak temizleyin, embriyoları dengelemek için %4'lük tricain ile anesteziye alın, 50 °C sıcaklıktaki bir ısıtma bloğunda %0,8'lik eritilmiş agarozu en az 15 dakika bekletin. Ardından, tüpü elinizde yaklaşık 30 saniye boyunca soğutun. Embriyoları eklemeden önce, bir cam pipet kullanarak bir embriyoyu minimum miktarda suyla çekin ve agarozun içine bırakın. Embriyoyu, yaklaşık 50 µL agarozla birlikte tüpten çekin ve içeriği 35 mm x 10 mm'lik bir Petri kabının merkezine boşaltın.Plastik bir ip kullanarak, kafes dışına çıkarılacak (uncaged) hücreler yukarı bakacak şekilde embriyoyu hızlıca yönlendirin. Agarın tamamen katılaşmasına ve kabı doldurmasına izin verin. %4 trica ve %0,003 PTU içeren yumurta suyu ile üçte iki oranında doldurulmuş kapla, embriyoları kafes dışı bırakma (uncaging) işlemine kadar ışık geçirmeyen bir kutuda saklayın.Floresein dekstranın lazerle kafes dışına çıkarılmasını (uncaging) gerçekleştirmek için, 40 x su daldırma objektif lensli bir bileşik mikroskop kullanın. Kafes dışına çıkarma işleminden önce, 365 nanometrelik bir boya hücresi ve %70/%30 ayırıcı dikroik aynaya sahip bir photonics instruments lazeri kullanıyoruz. Lazerin objektif ile parafokal hale getirilmesi ve lazeri odaklamak için uygun güce zayıflatılması gerekir.Aynalı bir cam lamı objektifin altına yerleştirin ve lamdaki çizikler görünür hale gelene kadar objektifi odaklayın. Lazerin tek bir darbe ile aynada net bir şekilde görülebilir bir çizik oluşturması için lazer atenüatörünü ayarlayın, objektif odağını yukarı ve aşağı hareket ettirerek düzenleyin. Eğer lazer objektif odak dışındayken bir çizik oluşturabiliyorsa, lazer odağını çeyrek oranında ayarlayın.Yukarı veya aşağı ayarlayın. Lazer aynayı çizebilene kadar tekrarlayın. Sadece objektif odaklandığında, monte edilmiş embriyoyu objektifin altına yerleştirin ve serbest bırakılacak (uncage) bölgeye odaklayarak serbest bırakma işlemini gerçekleştirin.İlgilenilen bir hücreye odaklanın ve iki ila üç hertz hızında 10 ila 20 kez pulse uygulayın. Uncaging işleminden sonra, agarı pensle soyarak embriyoyu serbest bırakın ve embriyoları %0,003 PTU içeren yumurta suyuna yerleştirin. Embriyoları oda sıcaklığında iki ila dört saat veya 4 °C'de gece boyunca antikor tespit edici sabitleyicide sabitleyin.Fiksatif maddesini uzaklaştırın ve yerine %100 metanol ekleyin. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Ardından metanolü uzaklaştırın ve yerine taze %100 metanol ekleyin.Embriyoları en az 30 dakika boyunca eksi 20 °C'de metanol içinde saklayın. Epitoplar bozulmaya başlamadan önce embriyoları metanolde iki haftaya kadar saklayabilirsiniz. Embriyoları oda sıcaklığında; %75 metanol %25 bir x fosfat tamponlu salin (0.1% tween 20 ile), %50 metanol %50 bir XPBS tween 20 ve ardından %25 metanol %75 bir XPBS tween 20 ile beşer dakikalık yıkamalar yaparak yeniden hidrate edin, ardından bir XPBS tween 20 içinde beşer dakikadan üç kez yıkayın.Embriyolar 24 saatten daha yaşlıysa, bunları mililitre başına 10 µg Proteinaz K içeren XPBS tween 20 ile permeabilize edin. Permeabilizasyon süresi embriyo evresine bağlıdır. Proteinaz K içerisinde beş dakika yeterlidir.Embriyolar fertilizasyon sonrası 24 ile 48 saat arasındaysa, daha yaşlı larvalar için daha fazla süre gerekebilir. Oda sıcaklığında 20 dakika boyunca bir antikor sabitleyici ile yeniden sabitleyin. Embriyoları oda sıcaklığında, 1X PBS tween 20 içerisinde beş dakika boyunca beş kez yıkayın.Ardından oda sıcaklığında bir ila iki saat boyunca bloklama solüsyonunda inkübe edin. Primer antikorları bloklama solüsyonu ile seyrelterek hazırlayın. Daha sonra embriyoları primer antikorlar içeren solüsyon içerisinde dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca inkübe edin ve ertesi sabah embriyoları dört kez 1X PBS Triton X-100 ile yıkayın; floresan işaretli sekonder antikorları bloklama solüsyonu ile seyrelterek hazırlayın.Embriyoları, sekonder antikorlar içeren solüsyonda dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin. Bir XPBS Triton X 100 ile dört kez yıkadıktan sonra, embriyoları %50 gliserol %50 bir XPBS içerisinde oda sıcaklığında en az iki saat boyunca berraklaştırın. Ardından gliserol PBS karışımını uzaklaştırın ve %100 gliserol ekleyerek dört derece Celsius'ta gece boyunca inkübe edin.Kontrol ve foto-serbest bırakılmış larvalara ait sonuçlar, konfokal projeksiyonlar şeklinde sunulmuştur. Kontrol embriyolarına kafeslenmiş floresein enjekte edilmiş ancak döllemeden 48 saat sonra foto-serbest bırakma işlemine tabi tutulmamıştır. Kontrol embriyosu, pineal komplekste GFP işaretlemesi göstermektedir.Bazı noktasal arka plan etiketlemeleri mevcut olsa da, etiketli floreseinle ilgili herhangi bir lokalize birikim saptanamamıştır. Foto-çözülmüş embriyolar, bazı GFP etiketli hücrelerde çözülmüş floresein birikimini net bir şekilde göstermektedir. Bunlar, 24 saat önce foto-çözülme yoluyla hedeflenen hücrelerin soyundan gelenlerdir. Küçük modifikasyonlarla.Bu prosedür, döllenmeden sonraki 48. saate kadar zebrafish embriyosundaki hemen hemen her dokunun soy hattı etiketlemesi için kullanılabilir.

lineage-labeling-zebrafish-cells-with-laser-uncagable-fluorescein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu protokol zebrafish embriyolar yaşayan tek tek nöronların veya nöral krest hücreleri görüntüleme açıklar. Bu yöntem, floresan konfokal zaman atlamalı mikroskopi kullanılarak cep davranışlar ve aktin lokalizasyonu incelemek için kullanılır.

Zebra balığı Embriyolar Bireysel Nöronlar ve Sinir Crest Hücreler Aktin Sitoiskelet Hücre Motilite ve Canlı Görüntüleme

Erken embriyo şekli morfogenetik süreçleri anlamanın anahtarı, yüksek çözünürlükte görüntü hücrelerinin yeteneği. Biz burada tüm zebrafish embriyolar membran hedefli Yeşil Floresan Protein hücrelerin tek hücreler veya küçük kümeler etiketleme için kullanılan bir tekniktir açıklar.

Zebra balığı Beyin Etiketleme ve Görüntüleme Hücreleri

Dying hücreler komşu hücrelerle birlikte daralma bariyer fonksiyonunu bozmadan epitel dokuların ekstrüde. Gelişmekte zebrafish optik netlik epitel yaşam ekstrüzyon görselleştirmek için mükemmel bir sistem sağlar. Burada hücresel çözünürlükte larva zebrafish epidermisin neden ve görüntü ekstrüzyon yöntemleri açıklanmaktadır.

Gelişmekte olan Zebra balığı Epidermis Hücre Ekstrüzyon Canlı Görüntüleme

Safir femtosaniye lazer osilatör: Ti bir yöntem olup, bir iki-fotonlu emme ile bir kafes floresan proteini içeren tek bir hücre photoactivate için tarif edilmiştir. Kader haritası için fotoaktive hücre, immunohistokimya kullanılır. Bu teknik, her hücre tipi için de uygulanabilir.

Zebra balığı Tek Hücre Kader Haritalama

Fonksiyon-Spacer-Lipid (FSL) yapıları canlılık kaybı olmadan, canlı hücreler ve virionlar yüzey özelliklerinin değiştirilmesine izin verir. Bu yöntem, sadece basit bir hücre / virion ve spontan ve kararlı bir yüzey dahil oluşur FSL inşa çözüm temas gerektirir.

FSL oluşturur: immunoseparasyon bir Aralığı Hücre / virion Yüzeyleri değiştirmek için Basit Bir Yöntem, Canlılık Etkileyen olmadan

Zebrabalıkları gelişimi embriyo düşük konsantrasyonlu agaroz ile optik bakımdan saydam bir plastik hortumlar gömülür ışık mikroskobu ile levha gün boyunca takip edilebilir.

Çok katmanlı Zebra balığı uzun vadeli Işık Sayfalık Mikroskopi için Montaj

Organellerin ve diğer hücre altı yapıların dinamik davranışlarını in vivo olarak görüntülemek, fizyolojik ve hastalık durumlarındaki işlevlerine ışık tutabilir. Burada, iki organeli, sentrozomları ve mitokondriyi genetik olarak etiketlemek ve dinamiklerini geniş alan ve konfokal mikroskopi kullanarak canlı zebra balığı embriyolarında görüntülemek için yöntemler sunuyoruz.

Yaşayan Zebra balığı Embriyo Hücre alt yapıları görüntüleme

Tek tek hücrelerde yönlendirilmiş strese veya ölüme neden olacak hedefli manipülasyonların gerçekleştirilmesi nispeten zor olmuştur. Burada, hücre kültüründe ve canlı hayvanlarda tek tek hücreleri seçici olarak strese sokmak ve öldürmek için tek hücre çözünürlüklü bir ablasyon yaklaşımı, standart bir konfokal UV lazere dayalı olarak açıklanmaktadır.

Konvansiyonel UV Lazer konfokal mikroskopi kullanılarak Tetikleme Hücre Stres ve Ölüm

Kirpikler geliştirme için uygun organogenesis hayati önem taşımaktadır. Bu iletişim kuralı etiket ve Zebra balığı siliyer hücreleri görselleştirmek için en iyi duruma getirilmiş bir yöntemini açıklar.

Zebra balığı bütün Dağı Floresan Situ hibridizasyon ve ayirt kombine bir protokol aracılığıyla Multiciliated hücrelerde görüntülenmesi

Lazer ablasyon biyolojik sistemlerde rejenerasyon eğitimi için yaygın olarak uygulanan bir teknolojidir. Sunulan protokol, lazer ablasyon için standart bir lazer tarama konfokal mikroskobu ve zebrabalığı lateral hattında ki internöromast hücrelerinin yenilenmesinin daha sonra zaman atlamalı görüntülemesini açıklar.

Zebrabalığı İnternöromast Hücrelerinde Konfokal Mikroskop Tabanlı Lazer Ablasyon ve Rejenerasyon Tonu

Burada, özellikle zebra balıklarında düşük bolluktaki proteinleri görselleştirmek için yararlı olan, yeni geliştirilen ve modifiye edilen bir in vivo sistem olan zebra balığı larvalarında proteinleri floresan protein etiketi ile etiketlemek için bir protokol sunuyoruz.

Zebra balıklarında düşük eksprese edilen proteinleri görselleştirmek için floresan etiketleme

Öğrenin, zebra balığı embriyolarında UV lazer ile kafesli fluoressein aktivasyonu kullanarak hücre soy hattı etiketleme yöntemini. Bu teknik, immünofloresan mikroskopi ile hücre kaderini izlemeyi sağlar.

Lazer Uncagable Floresein Dextran'ın Zebra balığı Hücre Lineage Etiketleme

Daha fazla video keşfet