Co-uyarıcı Sinyal Abluka Alloantigen Uyarım İnsan periferik kan mononükleer hücreleri içinde Alloantigen özel anerji indüksiyonu

Aşağıdaki deneyin genel amacı, T hücrelerinin CD 28 reseptörü üzerinden antijen sunan hücre ko-stimülasyonunu engelleyen antikorların varlığında, alıcı allo antijenleri ile ex vivo stimülasyon yoluyla alıcıya allo-spesifik donör T hücrelerini enerjize etmektir. Bu işlem, öncelikle iki farklı sağlıklı donörden PBMC izole edilerek gerçekleştirilir. Ardından, CD 28 stimülasyonunu engellemek amacıyla B 7.1 ve B 7.2 ligandlarına karşı monoklonal antikorların varlığında, HLA uyumsuz PBMC popülasyonlarının inkübe edilmesiyle toplu bir allo-enerjize edici ko-kültür kurulur.

Ardından, allo enerjizasyonun etkinliği, primer ve sekonder karışık lenfosit reaksiyonları (MLR) ile ölçülür. Son olarak, allo enerjizasyonun allo spesifitesi, üçüncü taraf ve CMV spesifik yanıtlar belirlenerek ölçülür. Elde edilen sonuçlar, donör T hücrelerinin sonraki allo antijenik stimülasyona karşı hipo-responsif hale getirildiğini, ancak allo-reaktif olmayan donör T hücrelerinin bozulmadan ve fonksiyonel kaldığını göstermektedir.

Bu stratejiyi, HLA uyumsuz kök hücre transplantasyonu sırasında ve sonrasında allo-enerjize donör T hücrelerinin infüzyonuna yönelik önceki ve devam eden pilot klinik çalışmalarda başarıyla uyguladık; manipüle edilmemiş HLA uyumsuz transplantasyon alan alıcıların tarihsel kontrollerine kıyasla iyileşmiş immün rekonstitüsyon, daha az enfeksiyon ve daha hafif seyreden akut ve kronik graft versus host hastalığı gözlemledik. Allo-anodizasyon stratejisinin temel bir avantajı, tekniğin patojen spesifik veya tümörle ilişkili antijen spesifik T-hücre yanıtlarını azaltmaması veya donör T-hücre havuzundan CD4 regülatör T hücrelerini elememesi nedeniyle hedef dışı etkilerin minimize edilmesidir; bu da prosedürün etkili olduğunu kanıtlamaktadır. Laboratuvarımızda uzman bilim insanı olan Christine Vin prosedürü gösterecektir. İlk adım, iki sağlıklı gönüllü donörden kan almaktır.

Bir donörden alınan hücreler yanıtlayıcı, başka bir donörden alınan hücreler ise uyarıcı olarak görev yapacaktır. Ardından, fial pac kullanarak yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile kandan PBMC izole edin. Trian blue ile hücrelerden küçük bir miktar ayırın ve hemo cytometer reus kullanarak canlı PBMC sayısını belirleyin.

Her donörden alınan PBMC'leri, ayrı 15 mililitrelik konik tüplerde, mililitre başına 1 milyon canlı hücre konsantrasyonunda 10 mililitre tamamlanmış kültür medyuma dağıtın. Toplu allo-enerjize edici ko-kültürü kurmak için donör PBMC tüplerinden birini stimülatör, diğerini ise yanıtlayıcı olarak belirleyin.

Belirlenmiş stimülatör 15 mililitrelik tüpe 100 mikrogram anti B 7.1 ve anti B 7.2 antikoru ekleyin. Tüpü hafifçe çalkalayın ve 30 dakika boyunca inkübe edin. İnkübasyon süresinin ardından stimülatör PBMC'leri ışınlayın ve gaz geçirgen kapaklı bir T 25 50 santimetreküp hücre kültürü flaskına ekleyin.

Balona "bulk allo coal kültürü" etiketini yapıştırın. Ardından, diğer donörden alınan, tam besiyerinde mililitre başına 1 milyon hücre konsantrasyonundaki 10 mililitre yanıtlayıcı PBMC'yi balona ekleyin. Balona ek olarak 100 mikrogram antib 7.1 ve Antib 7.2 antikorlarının her birinden ekleyin ve balonu 72 saat boyunca bir inkübatöre dik olarak yerleştirmeden önce nazikçe karıştırın.

Ardından, bloklayıcı antikorlar içermeyen bir toplu kontrol ko-kültürü için 10 milyon stimülatör PBMC'yi daha ışınlayın ve ardından bunları T 25 50 cubic centimeter hücre kültür flaskına ekleyin. Flaskı toplu kontrol ko-kültürü olarak etiketleyin. Toplu allo-enerjize ko-kültür için kullanılan responder PBMC'lerin 1 milyon per milliliter konsantrasyonda, komple medyum içinde 10 mililitresini flaska ekleyin ve flaskı 72 saat boyunca bir inkübatöre dik olarak yerleştirmeden önce nazikçe karıştırın.

Bir sonraki adım, dökme ko-kültürlerin etiketlendiği günle aynı günde, allo-enerjize donör T hücresi havuzunun fonksiyonunu ölçmektir. Ölçülecek üç zaman noktasının her biri için bir adet alt kısmı U şeklinde 96 kuyucuklu plaka primer MLR hazırlayın. Ardından, dökme kontrol ve allo-enerjize ko-kültürlerin her birinden 5 mL'yi 15 mL'lik tüplere boşaltın.

Ardından, her tüpten 200 µL hücre süspansiyonunu, üç plakanın her birindeki üçlü kuyucuklara pipetleyin. Toplu kontrol soğuk kültürlerinden gelen hücreler için bu kuyucukları "ko-stimülatuvar blokaj yok" veya "no CSB", toplu allo-enerjize soğuk kültürlerden gelen hücreler için ise "CSB" olarak etiketleyin. Daha sonra, negatif kontroller olarak her plakadaki altı kuyucuğa 200 µL komple medya ekleyin.

Son olarak, buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin ve plakaları, toplu ko-kültürlerin kurulumundan 72 saat sonra inkübatöre yerleştirin; ölçülecek üç zaman noktasının her biri için bir adet UBO 96 kuyucuklu plakayı sekonder MLR olarak etiketleyin. Sekonder MLR için responder hücreleri hazırlamak amacıyla, toplu kontrol ve allo-enerjize ko-kültürlerin her birinden 5 mL'lik porsiyonları 15 mL'lik tüplere aktarın ve tüpleri oda sıcaklığında 2000 RPM'de 5 ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatantları dikkatlice aspire ederek, peletleri dağıtarak ve her tüpe 10 mL komple besiyeri ekleyerek hücreleri iki kez daha yıkayın ve ikinci yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyin.

Hücreleri bir mililitre komple besiyerinde yeniden süspande edin. Canlı hücreleri saymak için tripan mavisi boyaması kullanın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1 milyon canlı yanıtlayıcı hücre olacak şekilde ayarlayın. Her tüpten 100 mikrolitre hücre süspansiyonunu, her plakanın üç tekrarlı kuyucuklarına pipetleyin.

Bu kuyucukları önce birinci taraf veya FP alaoy stimülasyonu olarak etiketleyin. Ardından, her tüpten 100 µL hücre süspansiyonunu her plakadaki diğer üç kuyucuğa pipetleyin ve bu kuyucukları, allo için birinci taraf stimülatör PBMC sağlamak amacıyla kullanılan aynı donörden gelen CD 3/28 stimülasyonu PBMC olarak etiketleyin. Energize ve kontrol ko-kültürleri, sekonder MLR için stimülatör hücreler olarak kullanılır; birinci taraf donör PBMC'lerini 1 milyon/mL konsantrasyonda 10 milyon olacak şekilde süspanse edin ve radyasyon uygulayın.

Her bir sekonder MLR plakasındaki fp allo restimulation olarak etiketlenmiş kuyucuklara 100 µL ışınlanmış stimülatör hücre ekleyin. Pozitif kontroller için, her bir sekonder MLR plakasındaki CD 3 28 stimulation olarak etiketlenmiş kuyucuklara birer µL CD3 ve CD28 monoklonal antikorları ve 98 µL komplet besiyeri ekleyin. Ayrıca, negatif kontrol olarak hizmet etmesi için her plakadaki altı boş kuyucuğa 200 µL komplet besiyeri ekleyin ve buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin.

Plakaları inkübatöre yerleştirin. Bir sonraki adım, üçüncü taraf donör olarak adlandırılan yeni bir sağlıklı donörden izole edilen allo PBMC'lerin özgünlüğünü ölçmektir; bu hücreler, sekonder bir MLR'de allo işleminin özgünlüğünü test etmek için kullanılır. Üçüncü taraf PBMC'leri mililitrede 1 milyon hücre olacak şekilde süspande edin ve sekonder MLR özgünlüğü üçüncü, beşinci ve yedinci günler için 3 adet 96 kuyucuklu plakayı işaretleyip ışınlayın.

Özgüllüğü ölçmek için ikincil MLR için yanıtçı hücreleri hazırlamak üzere, her bir toplu kontrol ve allo enerjize eden ko-kültürden beş mililitreyi 15 mililitrelik tüplere aktarın ve tüpleri 2000 RPM'de beş ila 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, süpernatanları dikkatlice aspire ederek, peletleri dağıtarak, her tüpe 10 mililitre komple ortam ekleyerek ve ikinci yıkamadan sonra hücreleri tekrar santrifüjleyerek hücreleri iki kez yıkayın. Hücreleri bir mililitre komple ortamda yeniden süspande edin.

Hücreleri saymak için trypan mavi boyama yapın ve hücre konsantrasyonunu mililitre başına 1 milyon canlı yanıtlayıcı hücre olacak şekilde ayarlayın; ardından her tüpten 100 µL hücre süspansiyonunu her plaktaki üç tekrar kuyucuğa pipetleyin. Bu kuyucukları TP veya üçüncü taraf allo stimülasyonu şeklinde etiketleyin. Daha sonra, TP allo stimülasyonu olarak etiketlenen kuyucuklara 100 µL ışınlanmış TP stimülatör hücre ekleyin.

Patojenlere karşı verilen allo yanıtlarının özgüllüğünü daha fazla test etmek için, daha önce CMV'ye karşı proliferatif yanıtları belirlenmiş donörlerden alınan PBMC'lerin enerjizasyonundan sonra ölçümler yapılır; 3 96. Kuyucuklu plakaları "sekonder M-L-R-C-M-V üçüncü, beşinci ve yedinci gün" şeklinde etiketleyin ve bulk kontrol ile allo enerjize eden ko-kültürlerin her birinden 5 mL'yi 15 mL'lik tüplere aktarın. Ardından hücreleri yıkayın, sayın ve complete medyada 1 milyon/mL olacak şekilde resüspande edin; her tüpteki hücre süspansiyonundan 100 µL'yi her plakadaki üç kuyucuğa pipetleyin ve bu kuyucukları "CMV stimülasyonu" olarak etiketleyin.

Ardından, CMV stimülasyonu olarak etiketlenen kuyucuklara, 100 µL tam ortam içinde 0.1 µL CMV lizatı ekleyin. Daha sonra, negatif kontrol olarak her plakadaki altı kuyucuğa 200 µL tam ortam ekleyin. Son olarak, buharlaşmayı azaltmak için tüm boş kuyucuklara 200 µL PBS ekleyin ve primer ile sekonder MLR'de proliferasyonu ölçmek için plakaları inkübatöre yerleştirin.

Plakların hasadından 16 saat önce, negatif kontrol ve hücre içeren kuyucuklara bir mikro küri trityumla işaretli timidil ekleyin. TomTec hasat cihazı veya benzeri bir cihaz kullanarak her plak için timidili tek bir filtre matı üzerinde toplayın. Filtre matlarını bir saat boyunca kurutun.

Ardından bunları ayrı örnek torbalarına yerleştirin. Her birine beş mililitre sintilasyon sıvısı ekleyin ve kapatın. HLA uyumsuzluğu stimülatör ve yanıtlayıcı PBMC kullanarak, filtre matlarını bir wallach mikro beta sintilasyon sayacı veya benzeri bir cihazla okuyarak deneyin son 16 saatindeki tri thymidine inklüzyonunu ölçün.

Bu şekilde, primer MLR'de ko-stimülatuar blokajın varlığının, yanıt veren PBMC'lerin beşinci gündeki ortalama allo proliferasyonunu, ko-stimülatuar blokajın olmadığı kontrol primer MLR'sinde görülenin yaklaşık %30'una düşürdüğü görülebilir. Bu, beşinci günde primer allo proliferasyonunda yaklaşık %70'lik bir ortalama inhibisyona eşdeğerdir. Bu şekilde görüldüğü üzere.

Bu şekilde, ikincil MLR'de, beşinci gündeki allo-enerjize PBMC'lerin birinci taraf allo proliferasyonunun genellikle kontrol PBMC'lerde görülenin %10 ila %15'i olduğu görülebilir. Bu, %85 ila %90'lık bir ortalama proliferasyon inhibisyonuna eşdeğerdir ve allo-enerjize PBMC'lerin birinci taraf allo stimülatörlerine karşı hipo-responsif olduğunu göstermektedir. Bu şekilde görüldüğü üzere, allo-enerjize donör periferik kan mononükleer hücreleri için optimize edilmiş dökme ko-kültürler iki ila üç saat içinde kurulabilir.

Bu yaklaşım, allo reaktivitesi azaltılmış ancak patojene özgü bağışıklığı korunmuş donör T hücreleri üretmek amacıyla klinik kullanım için kolayca standardize edilebilir. Bu hücreler, aşırı graft-versus-host hastalığına yol açmadan immün rekonstitüsyonu iyileştirmek için allojenik hematopoetik kök hücre transplantasyonu kapsamında adoptif olarak transfer edilebilir. Bu prosedürü uygularken, hızlı çalışmanın önemli olduğunu unutmamak gerekir.

Bu işlem, hücrelerin canlılığını korumaya yardımcı olur ve antijen sunan hücrelerin spesifik olmayan aktivasyonunu veya kaybını önler. Stimülatörler veya yanıtlayıcılar için kriyoprezerve PBMC kullanılıyorsa, dondurulmuş hücrelerin canlandırılması için tutarlı şekilde yüksek canlı hücre verimi sağlayan valide edilmiş bir protokol kullanılmalıdır. Bu videoyu izledikten sonra, insan donör periferik kan mononükleer hücrelerinin nasıl allo-anize edileceğini ve bu prosedürün etkinliğini ve özgünlüğünü değerlendirmek için yapılacak analizleri iyi bir şekilde kavramış olmalısınız; bu strateji, allojenik hematopoetik kök hücre transplantasyonu sonrası immün rekonstitüsyonu iyileştirmek için klinik olarak kullanılabilecek, allo yanıtları azaltılmış insan donör T hücreleri üretmek için kullanılabilir.