Proteolitik Degradable 3 Boyutlu Sistem Yumurtalık Folikül Encapsulation ve Kültür Bir Yöntem

Bu protokol, in vitro kültür için fibrin aljinat iç içe geçen ağda yumurtalık foliküllerinin yeni bir kapsülleme yöntemini tanımlar. İkincil folikül, oosit gelişimini, folikül kapsüllemesini ve üç boyutlu bir ortamda kültürü destekleyen, çoklu hücresel bölmeler arasındaki iletişimi desteklerken ve folikülün bu küresel yapısını korurken folikül genişlemesine izin veren birkaç somatik hücre tabakası ile çevrili merkezi olarak yerleştirilmiş bir oositten oluşur. Bu protokolün ilk adımında, damla yöntemi için 16 günlük fare yumurtalıklarından ikincil foliküller izole edilir.

Folikülleri durulayın ve bir kapsülleme çözeltisine aktarın. Her bir folikülü fibrinojen aljinat solüsyonu pipeti ile trombin kalsiyum solüsyonuna aspire edin ve boncukların paraform yöntemi için çapraz bağlanmasına izin verin. Tek tek folikülleri paraform kaplı bir cam slayt üzerinde fibrinojen aljinat çözeltisi damlalarına aktarın ve F-A-I-P-N çapraz bağlamayı başlatmak için trombin çözeltisi ekleyin.

Daha sonra kapsüllenmiş folikülleri bir büyüme ortamına aktarın ve FA IPN'deki kapsüllenmiş folikül olan görüntüye aktarın. Bu sistem, yumurta üretmek için olgunlaşmamış foliküllerin büyümesini ve gelişmesini desteklemek için yapısal desteği biyolojik duyarlılıkla birleştirdiğinden, genişlemeyi sınırlamadan hücre hücresi temaslarını korumak için kültür hücresi agregatları için uygulanabilir. Merhaba, benim adım Lonnie Shea ve üç odun damlası ile işbirliği yaparak, yumurtalık foliküllerinin in vitro olgunlaşması için bir kültür sistemi geliştirdik.

Ve bu kültür çalışması gerçekten biyomühendislik ve üreme biyolojisi arasındaki gerçek işbirliğini yansıtıyor. Ve bugün, bu kültür sistemini gerçekten geliştiren insanlar size bu yöntemleri sunacaklar. İlk olarak, Ariel Checkoff, biyomateryal sistemini geliştiren biyomühendislik alanında doktora sonrası bir araştırmacıdır.

Sırada, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı'nda üreme biyoloğu olan ve yumurtalık dokusu için işleme prosedürlerini geliştiren Minsu var. Ve birlikte size yumurtalık dokusunu gerçekten kapsülleme ve kültürleme yöntemlerini sunacaklar. Mevcut yöntemlerin tarif edilen tekniğinin ana avantajı, düz yüzeyli plastik üzerindeki standart kültür gibi, fibrin aljinat sisteminin, hızla genişleyen folikül için mekanik olarak dinamik bir ortam sunarken, folikülün üç boyutlu mimarisini desteklemesidir.

Mevcut insandaki dinamik mekanik mikro çevre, bu teknoloji kütle modelinden potansiyel klinik uygulamaya çevrildiğinde ek avantajlar sağlar, çünkü insan folikülünde olgun ve gübre yumurtaları üretmek için çok daha kapsamlı bir büyümeye ihtiyaç duyar En iyi sonuçlar için. Bakteriyel kontaminasyonu en aza indirmek için pH kontrolü için L 15 bazlı ortamda 37 santigrat derecede, sıcaklık kontrolü için ısıtılmış aşamalarda ve temiz bir tezgahta tüm diseksiyonları gerçekleştirin. Taze disseke edilmiş yumurtalıkları% 0.1 kollajenaz ve% 0.1 DNA içeren bir ila iki mililitre bakım ortamı içeren 35 milimetrelik yeni bir Petri kabına aktarın ve bir karbondioksit inkübatörde 15 dakika inkübe edin.

Kollajenazı çıkarmak için numuneleri DM'de yıkayın ve daha sonra folikülleri yumurtalıktan izole etmek için taze DM ile 35 milimetrelik bir Petri kabına aktarın. İnsülin şırıngalarına bağlı 2 28 5 8 gauge iğneleri kullanarak folikülleri tüm yumurtalıktan nazikçe uzaklaştırın. Folikülün bütünlüğüne zarar vermeden mümkün olduğunca çok stroma hücresini çıkarın.

Yumurtalık başına 130 ila 150 mikron çapında 20 ila 40 ikincil folikülü inceleyin. Bu foliküller genellikle iki ila üç tabaka granüloz hücresine sahiptir. Şimdi bir IVF kabına, merkezi kuyucuğa bir mililitre mm ve dış halkaya üç mililitre mm ekleyin.

Sağlam folikülleri pipetle IVF kabının dış halkasına aktarın. Bu IVF kabını inkübatörün içinde 37 santigrat derece ve% 5 karbondioksitte tutun. Tüm foliküller toplandıktan sonra.

Numuneleri, iki ila üç granüloz hücre tabakası dahil olmak üzere sağlıklı morfoloji sergileyen, oosit ve granüloz hücreleri arasında ayrım olmayan ve sağlam ve yuvarlak oositler sergileyen 130 ila 150 mikron boyutundaki folikülleri seçmek için beş ila sekiz kat büyütme ile diseksiyon mikroskobu altında inceleyin. Sağlıklı folikülleri kapsülleme için başka bir IVF kabının ortasına aktarın. Folikül kapsüllemenin damla yöntemi için, bir IVF kabının çözülmesinin orta kuyusuna mililitre trombin çözeltisi başına bir mililitre 50 uluslararası birim ekleyin ve fibrinojen stok çözeltisini buz üzerinde tutun.

Ve fibrinojeni kapsüllemeden hemen önce oda sıcaklığına getirin. Kullanmadan hemen önce. Fibrinojen aljinat çözeltisini bir kez PBS% 0.5 aljinat ve mililitre başına 50 miligram karıştırarak hazırlayın.

Fibrinojen, 1.7 mililitrelik steril mikro santrifüj tüpünde ikiye bir oranında. Buharlaşmayı azaltmak için hafif bulanık çözeltiyi nazikçe girdaplayın ve santrifüjleyin. Bir IVF çanağı yerinin dış halkasının köşesindeki diseksiyon mikroskobu üzerindeki ısıtma aşamasını kapatın.

Kapsülleme için 90 mikrolitre fibrinojen aljinat çözeltisi ve bir yıkama aşaması için 10 mikrolitrelik ikinci bir damla. 10 ila 15 folikülü minimum miktarda kültür ortamı ile 10 mikrolitrelik damlaya aktarın ve daha sonra minimum miktarda çözelti ile hızlı bir şekilde karıştırın, tüm folikülleri 90 mikrolitrelik damlaya aktarın ve 10 mikrolitrelik bir uç kullanarak beş mikrolitre fibrinojen aljinat çözeltisi içinde bir folikülü aspire edin ve fibrinojen aljinat çözeltisini folikül ile birlikte IVF çanağının ortasındaki trombin çözeltisine bırakın. Tüm foliküller kapsüllenene kadar bu adımı tekrarlamaya devam edin.

Jeli trombin kalsiyum çözeltisinde çapraz bağlamak için boncukları beş ila yedi dakika bekletin. Fibrin oluştukça boncuklar koyulaşacaktır. Boncukları, daha koyu boncuklardan başlayarak bakım ortamına aktarın.

İlk olarak, 37 santigrat derecede 15 ila 30 dakika inkübe edin ve kalan trombini durulayın. Son olarak, boncukları bir kültür plakasına ve görüntüye aktarın. Fibrinojen aljinat çözeltisini hemen% 0.5 aljinat ve mililitre başına 50 miligram karıştırarak hazırlayın.

Fibrinojen: 1.7 mililitrelik steril mikro santrifüj tüpünde bire bir oranda, parfüm kaplı cam üzerine 7.5 mikrolitre damla fibrinojen aljinat karışımı damlatın. Üç milimetrelik bir ara parça ile kaydırın ve her damlaya bir folikül aktarın. Minimum miktarda medya ile.

Damlayı folikül ile dokunmadan veya karıştırmadan her damlaya 7.5 mikrolitre trombin solüsyonu ekleyin, çünkü jel neredeyse anında oluşur. Jelleri ikinci para film kaplı camla kaplayın. 100 milimetrelik bir tabağa kaydırın ve beş dakika boyunca bir inkübatörde baş aşağı yerleştirin.

Yapışkan boncukları gerekirse forseps kullanarak bakım ortamına aktarın ve ardından iki günde bir bir kültür kuyusuna aktarın. Kültürlenmiş folikülleri bir ışık mikroskobu kullanarak görüntüleyin ve folikül çapını görüntü ile ölçün J. Ayrıca büyüme ortamının yarısını her iki günde bir taze Dengeli büyüme ortamı ile değiştirin Sekiz günlük kültürden sonra, fibrin bileşenlerinin tamamen bozulması nedeniyle hidrojel berrak görünmelidir ve foliküller, çapı 400 mikrondan daha büyük olan nihai boyutlarına ulaşabilir. Büyüme ortamını çıkarın ve mililitre başına 10 mikrolitre 10 uluslararası birim ekleyin.

Aljinatı bozmak için alfa mem'deki aljinat lia. Plakayı 25 ila 30 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra folikülleri kısmen çözünmüş boncuklardan künt uçlu bir uçla çıkarın.

Folikülleri, aljinat liyazını yıkamak için diseksiyon ortamı ile bir IVF kabının dış halkasına aktarın ve ardından iç halkaya aktarın. Şimdi antral folikülleri, HCG ve EGF içeren olgunlaşma ortamı ile IVF çanağının dış ve daha sonra iç halkasına aktarın, 15 ila 16 saat boyunca bir karbondioksit inkübatöründe inkübe edin. Kümülüs hücresini çıkarmak için kümülüs hücresi genişlemesi için kültürleri inceleyin.

Mililitre başına 0.1 miligramlık bir nihai konsantrasyona daha yüksek IDE çözeltisi ekleyin ve% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede iki ila üç dakika inkübe edin. Ağız pipetini serbest bırakın. Kümülüs hücrelerinden gelen oositler nihayet mikroskop altında olgunlaşma aşamalarını belirler.

Aljinat, nazikliği ve ağ boyutu, kontrol edilebilir sertlik ve biyolojik eylemsizlik gibi biyokimyasal özellikleri nedeniyle in vitro folikül kültürü için uygun olan doğal bir biyomalzemedir. Küçük kapsüllenmiş foliküller, kültürün başlangıcında aljinatta düşük basınç kuvveti yaşarlar. Bununla birlikte, folikül genişledikçe, boncuktaki yer değiştiren hacim artar, bu da folikül genişlemesinin ters yönünde daha fazla sıkıştırma kuvveti ile sonuçlanır.

Tek tek polimerlerin zincirleri, çapraz bağlamadan önce fibrilin aljinat çözeltisi içinde tamamen dolaşır. F-A-I-P-N'nin her iki bileşeni de trombin ve kalsiyum folikülü karışımına maruz kaldıklarında hemen çapraz bağlanmaya başlar, kültür periyodu sırasında F-A-I-P-N'nin fibrin bileşenini bozar, bu da folikülün etrafında net bir daire ile gösterilir. Folikül 3D mimarisi, kalan aljinat tarafından desteklenir.

Bu görüntüler, 0, 4, 6 ve sekizinci günden elde edilen M'ye kadar zaman içinde F-A-I-P-N'de ikincil folikül büyümesini gösterir, iki evre X.Polar cisimcikli bir pronin, fibrin bozunmasını yavaşlatmak için kültür ortamına eklenebilen bir proteaz inhibitörüdür. İlk dört gün içinde kültür ortamına mililitre aprotinin başına 0.01 TIU eklendiğinde, foliküller matrisi parçalayamaz. Ve bir proteinin çıkarılmasından sonra, foliküller büyümeye devam eder ve antral aşamaya ulaşır.

Bununla birlikte, foliküller başlangıçta daha yüksek bir aprotinin konsantrasyonunda kültürlenir, bu büyüme engellenir. Bugün, üç boyutlu bir fibrin aljinat ağında değişen folikül kapsüllemesi ve in vitro kültür için yeni bir teknik gösterdik. Sistem sadece kültür boyunca sağlam folikül yapısını korumakla kalmaz, aynı zamanda in vitro olarak başarılı foliküler oluşumu destekler, bu da M iki evre O bölgesi ile sonuçlanır.

Bu teknoloji, yumurtalık folikülünün nasıl çalıştığını keşfetmek için önemlidir ve daha genel olarak genç kanser hastalarına doğurganlık seçenekleri sağlama potansiyeline sahiptir. Bu kültür sistemi, hücre kümelerinin kültürü veya hücrelerin yapılar halinde organize oldukları için kültürü için kullanılabilir. Bu 3D kültür sistemleri, doku büyümesini moleküler olarak incelemek için değerli araçlar sağlayacaktır.