Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans

Prosedür, uzun ömür, üreme ve metabolizma üzerindeki etkisini incelemek için deniz zarafetindeki standart abased plaka üzerinde diyet kısıtlaması gerçekleştirir. Bu, öncelikle bir besin kaynağı olarak kullanılacak bakteri konsantrasyonunun doğru bir şekilde ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bakteri kültürünü uygun konsantrasyonlara uygun şekilde seyreltmektir.

Daha sonra öldürülmüş bakteri içeren bir SDR plakası hazırlayın. Son olarak, yaşla senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu ile SDR deneyleri kurun. Döl üretimi ve yaşam süresi ölçümlerinin sonuçları, gecikmiş ve azalmış döl üretiminin yanı sıra ortalama yaşam süresinin arttığını gösterebilir.

Bu tekniğin AZA ortamında Dian gibi 60'tan fazla yöntemin ana avantajı, tüm deneyin çoğu sıcak laboratuvar tarafından diyet kısıtlama deneyleri için kullanılan standart bir katı AGA tabanlı oyun üzerinde yapılması ve zarafetin her bir bakteri türü için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturmasıdır. lb agar üzerindeki taze bir çizgiden tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi seçin ve gece boyunca 37 santigrat derece çalkalayıcıda üç mililitre sıvı lb suyu kültürünü aşılayın. Gece boyunca kültürün seri iki kat seyreltmesini hazırlayın.

Daha sonra, her bir seyreltmenin absorbansını 600 nanometrede spektrofotometre ile üç kopya halinde ölçün. Her bir bakteri süspansiyonunu daha da düzleştirin, 1 milyon kat, 100 milimetre lb'lik bir agri plakası üzerinde her seyreltmenin 0.4 mililitre bakteri süspansiyonunu eşit şekilde tohumlayın ve 18 ila 24 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Her numune için mililitre başına koloni oluşturan birimleri hesaplamak için her bir plakada yetiştirilen bakteri kolonilerinin sayısını sayın.

Şimdi OD 600'ü bakteri konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak çizin ve ölçülen OD 600 değerleri ile OP 50 bakteri konsantrasyonları arasındaki ilişkiyi kurmak için doğrusal bir regresyon analizi yapın. Bu yöntem için, ad lido besleme koşulunda mililitre başına 10 ila 11. CFU'luk bir bakteri konsantrasyonu ve optimum DR besleme koşulu olarak mililitre başına 10 ila sekizinci CFU'luk bir bakteri konsantrasyonu kullanılır. Bununla birlikte, tam bir doza bağlı ilişki kurmak için dört ila altı farklı bakteri konsantrasyonuna ihtiyaç duyulabilir.

SDR ve yanıtları için. Altı ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derece çalkalayıcıda kültürlenmiş, üç mililitre sıvı LB et suyunda tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi içeren bir aşı hazırlayın. OP 50 kültürünü 500 mililitre LB suyu içeren yeni bir şişeye aktarın ve gerekirse bakterilerin doygunluğa ulaşması için gece boyunca büyütün.

OD 600'de absorbans ölçümü için OP 50 kültürünün uygun seyreltmesini hazırlayın. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için, bakterileri 20 dakika boyunca 1500 Gs'de santrifüjleme ile peletleyin. Süpernatanı çıkarın ve bakterileri mililitre başına 12. CFU'da bir kez 10'luk bir konsantrasyona yeniden süspanse edin.

Şimdi, mililitrelik pipet başına 12'nci CFU'nun 10'u ile yedinci CFU'nun 10'u arasında değişen altı farklı konsantrasyonda 10 mililitre bakteri kültürü hazırlayın. İki mililitre bakteri kültürünü 60 milimetre katılaşmış N GM plakasının merkezine doğrultun. Plakanın yüzeyine pipet ucuyla dokunmaktan kaçının, çünkü yüzeydeki çentikler solucanların havalandırmalara girmesine izin verir.

Plakaları bir saat boyunca 37 derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Daha sonra mililitre başına 100 mikrolitre 100 miligram karbonik soin ve mililitre başına 10 mikrolitre 50 miligram misin uygulayın, bakterilerin dinlenme büyümesi için her bir plakaya misin yapabilir. Farklı konsantrasyonlarda antibiyotikle öldürülmüş bakteri içeren plakaları, gelecekte bir aya kadar kullanmak üzere dört santigrat derecede saklayın.

Yeterli sayıda plakanın, tercihen tüm tesis için aynı partinin hazırlanması ve saklanması önemlidir. Bakterilerin canlılığını doğrulamak için en az bir ila iki gün önceden deney yapın. SDR plakalarından bazı bakterileri kazıyın ve karbonik, sein ve antimisin içeren boş bir N GM plakasına yayın.

Plakayı altı ila sekiz saat boyunca 37 santigrat derece inkübatöre yerleştirin ve bakteri üremesinin olmadığını onaylayın. Yaşam süresi analizi ve döl üretim profili oluşturma gibi SDR ile ilgili çalışmaların çoğu için, yaşla senkronize edilmiş bir solucan popülasyonunun hazırlanması esastır. Üreme açısından aktif 20 ila 30 yetişkini birkaç normal NGM plakasına aktarmak için bir platin solucan toplayıcı kullanın.

OP 50 ile. Deneyler için gerekli olan yumurta sayısına bağlı olarak daha fazla yetişkine ihtiyaç duyulabilir. Yumurtlamaya izin vermek için plakaları dört saat boyunca 20 santigrat derecede bırakın.

Yetişkinleri plakadan çıkarın ve tabaklarda yumurta olup olmadığını görsel olarak inceleyin. Plakaları 20 santigrat derecede inkübe etmeye devam edin, böylece döl son L dört gün bir yetişkin aşamasına geçmesine izin verir. Genellikle bu, 20 santigrat derecede N iki vahşi tip solucan için üç gün sürer.

Ömür boyu analizi için. Diyet kısıtlamasını başlatmak için 10 ila 12 günlük bir yetişkin solucanı bir SDR plakasına aktarın. Yeterli istatistik gücü elde etmek için, her SDR koşulu için toplam 60 ila 100 solucan kullanın.

Tüm solucanlar ölene kadar her iki ila üç günde bir her solucanın canlılığını puanlayın. Daha da önemlisi, açlıktan ölmemek için solucanları her gün taze SDR plakalarına aktarın. Bu kalibrasyon eğrisi, OD 600'e göre OP 50 konsantrasyonunu çizer.

Doğrusal regresyon analizi ile oluşturulan denklem, OP 50 bakteri konsantrasyonlarının gelecekteki tüm hesaplamaları için kullanılabilir. Bu çalışma, kronik SDR tedavilerinin farklı solucan suşlarının ortalama ömrü üzerindeki etkisini, yabani tip solucanların SDR'ye normal doza bağımlı yanıtına kıyasla analiz etmektedir. SDR'nin yaşam süresi etkisi, DR iki aşırı ekspresyonu ile kısmen baskılanırken, DAF 16 MU 86 mutasyonunun SDR'nin neden olduğu yaşam süresinin uzaması üzerinde hiçbir etkisi yoktur.

Bu videoyu izledikten sonra, deniz zarafetinde standart AGA tabanlı oyunda Dian'ı nasıl gerçekleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız.