Name: Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans /em (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 13 s
Description: Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta katı plaka tabanlı diyet kısıtlama protokolünü. Bu yöntem, öldürülmüş bakteri kullanarak yaşam süresi, üreme ve metabolizma üzerindeki etkileri incelemek için geliştirilmiştir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, A.-LH Nathan Şok Merkezi (P30 AG13283) ve Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA) R01 hibe (R01 AG028516) bir pilot ödül tarafından desteklenen

1. Bakteri konsantrasyonlarının tahmini için bir kalibrasyon eğrisinin oluşturulması Bu bölümde, C. Diyet kısıtlama deneyler için bir besin kaynağı olarak kullanılır, herhangi bir bakteri suşu (örneğin OP50, HT115) bakteri konsantrasyonu tahmini için bir yöntem açıklanır . elegans. Ayrı kalibrasyon eğrileri bakteri suşu kullanılan her tesis edilmelidir. <ol><li> E. tek bir koloni İnokülasyon coli OP50 bakteri, 3 ml sıvı LB suyu LB agar bakteri taze bir çizgi aldı . </li><li> 37 Yeri OP50 kültür ° C çalkalayıcı ve bakteri gecede büyümek için izin verir. </li><li> (2x, 4x, 8x, 16x, 32x) gece kültüründen bakteri süspansiyon seri 2 kat dilüsyonları hazırlayın. </li><li> Her seyreltme (optik yoğunluk) absorbansı 600 nm'de spektrofotometre tarafından üç nüsha olarak ölçün. </li><li> Ayrıca her bakteriyel süspansiyon 1.000.000 kat (iki kez 1000 kat seyreltme) sulandırmak. </li><li> 100 mm LB agar plaka üzerine eşit olarak her seyreltme bakteriyel süspansiyon 0.4 mL yayıldı. </li><li> 18-24 saat boyunca 37 ° C inkübatör OP50 LB tabak yerleştirin. </li><li> Her plaka üzerinde yetişen bakteri kolonilerinin sayısını sayın. Koloni sayımları, her bir örnek için mL başına cfu (koloni oluşturan birim) hesaplamak için kullanılır. </li><li> Bakteriyel konsantrasyonu (kob / ml) bir fonksiyonu olarak OD 600 komplo ve lineer regresyon analizi (Şekil 1) performans ölçülen OD 600 değerleri ve OP50 bakteri konsantrasyonları arasındaki ilişki kurulabilir. </li></ol> Çözümler: <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Luria Broth (LB), 1L: </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> Bacto-Tripton </td></tr><tr><td> 5 g </td><td> Maya Ekstraktı </td></tr><tr><td> 10 g </td><td> NaCl </td></tr></tbody></table> 1L deiyonize su ekleyin. Otoklav ve oda sıcaklığında saklayın. 2. Katı plaka tabanlı diyet kısıtlaması (SDR) plakalarının hazırlanması Bu bölüm katı plaka dayalı diyet kısıtlaması (SDR) deneylerde kullanılmak için plakalar hazırlanması açıklamaktadır. Normalde, düşünün bir bakteri konsantrasyonu 1 x 10 11 kob / ml ad libitum besleme durumu ve 1 x bu yöntem için en uygun DR beslenme koşulu olarak 10 8 kob / ml. Ancak, 4-6 farklı bakteri konsantrasyonları SDR ve yanıtları için tam bir doz-bağımlı bir ilişki kurmak için gerekli olabilir. <ol><li> E. tek bir koloni İnokülasyon 3 ml sıvı LB suyu Coli OP50 bakteri. </li><li> 37 ° C shaker'da OP50 kültür koyun ve 6-8 saat bakteriler büyümek için izin. </li><li> 500 ml LB suyu içeren yeni bir balona OP50 kültür aktarım ve 37 ° C çalkalayıcı gecede geri OP50 kültürünü yerleştirmek. </li><li> Bakteri konsantrasyonu (konsantrasyonu Bölüm 1 oluşturulan kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmıştır) belirlemek için OP50 kültürü OD 600 ölçün. Uygun dilüsyonları absorbans doğru bir ölçüm için gerekli olabilir. </li><li> 20 dakika 1500 g santrifüj Pelet OP50 bakteri. </li><li> 1 x 10 12 kob / ml 'lik bir konsantrasyon bakteriler tekrar </li><li> Altı farklı konsantrasyonlarda 10 ml bakteri kültürü hazırlayın: 1 x 10 12 10 11 10 10 10 9 10 8 10 7 kob / ml. </li><li> Pipet 0,2 ml 60 mm merkezi haline bakteri kültürü NGM plaka pekiştirdi. Yüzeyde nickler agar plakları içine yuva solucanlar izin, pipet ile plaka yüzeyine dokunmaktan kaçının. </li><li> 1 saat süreyle 37 ° C'lik inkübatöre yerleştirin plakalar. </li><li> Bakterilerin büyüme tutuklamak için her plaka 100mg/mL carbenicillin ve 50mg/mL kanamisin 10 mcL 10μL uygulayın. </li><li> Mağaza plakaları 4 farklı konsantrasyonlarda antibiyotik öldürülmüş bakteri ° C ileride kullanmak için (bir ay kadar). Tüm planlanan deney için önümüzdeki en az 1-2 gün yetecek kadar tabak hazırlamak ve saklamak için çok önemlidir. Aynı parti tüm deneyler için plakaların kullanılması tercih edilir. </li><li> Bakterilerin canlılığını doğrulamak için, SDR plakaları bazı bakteri kazımak ve carbenicillin ve kanamisin boş bir NGM plaka üzerine yayıldı. 6-8 saat 37 ° C inkübatör plaka koyun ve daha sonra bakteri büyümesi için (hiç bakteri büyüme dikkat edilmelidir) kontrol edin. </li></ol> Çözümler <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> Nematodu Büyüme Medya (NGM), 1L: </td></tr><tr><td> 3 g </td><td> NaCl </td></tr><tr><td> 2.5 g </td><td> Bacto-Peptonlu </td></tr><tr><td> 20g </td><td> Agar </td></tr></tbody></table>ove_content "&gt; 40 dakika için Otoklav ve soğuması için 65 ° C, daha sonra ekleyin: <table border="1"><tbody><tr><td> 1 ml </td><td> 1 M MgSO 4 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> 1 M CaCl 2 </td></tr><tr><td> 1 ml </td><td> 5 mg / ml Kolesterol </td></tr><tr><td> 25 ml </td><td> 1M potasyum fosfat, pH 6.0 </td></tr></tbody></table> 10 ml alikotları hemen 60 mm x 15 mm petri kutularının üzerine sıvı NGM dökün 3. SDR deneyler ayarlama Ömrü analizi ve doğurganlık profili, solucanlar yaş senkronize nüfus hazırlanması gibi SDR-ile ilgili çalışmalar, çoğu için çok önemlidir. Diğer çalışmalar için diyet kısıtlaması başlatmak için sadece bir SDR plaka düzenli bir OP50 plaka solucanlar aktarmak. Bu bölümde, SDR hayvanlar için bir ömür analizi kurmak için bir protokol, bir örnek olarak açıklanmıştır. <ol><li> OP50 birkaç düzenli NGM plakalar üzerine 20-30 üreme aktif yetişkin aktarmak için bir platin solucan toplayıcı kullanın. Deneyler için gerekli yumurta sayısına bağlı olarak, daha fazla yetişkin gerekli olabilir. </li><li> 20 ° C'de 4 saat boyunca yumurtlama izin plakaları bırakın. </li><li> Plaka yetişkin çıkarın. Tabaklar yumurta için görsel olarak kontrol edilmelidir. </li><li> 20 plakaları bırakın ° C ve döl Late-L4/day 1 yetişkin aşamaya geliştirmeye olanak sağlar. Genellikle, bu 20 N2 vahşi türleri solucanlar için 3 gün sürer ° C </li><li> Diyet kısıtlaması başlatmak için uygun bir gün 1 yetişkin SDR tabağa aktarın. </li><li> Ömrü analizi için, plaka başına 10-20 solucanlar, her SDR durum için 6-8 plakalarının toplam kurdu. </li><li> Tüm solucanların ölmüş kadar her 2 günde bir her solucanın canlılığı Puan. Solucanlar gıda yoksunluğu önlemek için her 12-48 saat taze SDR plakaları transfer olması kritik önem taşımaktadır. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Şekil 1'de gösterildiği OD 600 ile ilgili OP50 konsantrasyon tahmini için temsili bir kalibrasyon eğrisi bir komplo. Liner regresyon analizi tarafından oluşturulan denklem OP50 bakteri konsantrasyonları gelecekteki tüm hesaplamalar için kullanılabilir. Şekil 2'de gösterildiği gibi farklı solucan suşlarının ortalama ömrü kronik SDR tedavilerin etkisi assaying bir örnektir. Mavi çizgi SDR yabani tip solucanlar normal bir doza bağımlı bir yanıt temsil eder. Daf-16 (mu86) SDR-indüklenen ömrünü uzatma üzerinde hiçbir etkisi sahipken kırmızı çizgi, SDR ömrü etkisi kısmen DRR-2 oe tarafından bastırılmış olduğunu gösterir. C. ömrü analiz gerçekleştirmek için Detay yöntemi elegans önceki edebiyat 1-3 açıklanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 E. tahmini için bir kalibrasyon eğrisi Temsilcisi sonuç Coli OP50 konsantrasyon. OP50 konsantrasyonu ölçülen OD 600 değerlerinin bir fonksiyonu olarak çizilmiştir. Hata çubukları = 2x, 1.5x, 4x, 8x, 16x, 32x SD Gecelik bakteriyel kültür absorbans ölçümü önce sulandırılmış ve daha seyreltilmiş 1.000 x iki kez kob ölçümden önce oldu. <img src="/files/ftp_upload/2701/2701fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 C Temsilcisi sonucu elegans ömrü deneyi (Ching ve ark Şekil 4) SDR yanıt vahşi tip N2 hayvanlar (mavi) iki farklı mutantlar (yeşil ve kırmızı) ile karşılaştırarak. Hata çubukları = SEM

<ol><li>Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+aging+and+age-related+disease+by+DAF-16+and+heat-shock+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor.</a> Science. 300, 1142-1145 (2003).</li>
<li>Kenyon, C., Chang, J., Gensch, E., Rudner, A., Tabtiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+mutant+that+lives+twice+as+long+as+wild+type%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A C. elegans mutant that lives twice as long as wild type.</a> Nature. 366, 461-464 (1993).</li>
<li>Apfeld, J., Kenyon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+lifespan+by+sensory+perception+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Regulation of lifespan by sensory perception in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 402, 804-809 (1999).</li>
<li>Ching, T. T., Paal, A. B., Mehta, A., Zhong, L., Hsu, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((drr-2+encodes+an+eIF4H+that+acts+downstream+of+TOR+in+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">drr-2 encodes an eIF4H that acts downstream of TOR in diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Aging Cell. 9, 545-557 (2010).</li>
<li>Weindruch, R., Walford, R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeindruch%2C+R+%22The+Retardation+of+Aging+and+Disease+by+Dietary+Restriction%22">The Retardation of Aging and Disease by Dietary Restriction</a>. , Thomas. (1988).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subfield+history%3A+caloric+restriction%2C+slowing+aging%2C+and+extending+life%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Aging+Knowledge+Environ%22%5BJournal%5D)">Subfield history: caloric restriction, slowing aging, and extending life.</a> Sci Aging Knowledge Environ. , RE2-RE2 (2003).</li>
<li>Masoro, E. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+caloric+restriction+and+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Overview of caloric restriction and ageing.</a> Mech Ageing Dev. 126, 913-922 (2005).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axenic+growth+up-regulates+mass-specific+metabolic+rate%2C+stress+resistance%2C+and+extends+life+span+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Axenic growth up-regulates mass-specific metabolic rate, stress resistance, and extends life span in Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1371-1378 (2002).</li>
<li>Houthoofd, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((No+reduction+of+metabolic+rate+in+food+restricted+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">No reduction of metabolic rate in food restricted Caenorhabditis elegans.</a> Exp Gerontol. 37, 1359-1369 (2002).</li>
<li>Klass, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech Ageing Dev. 6, 413-429 (1977).</li>
<li>Bishop, N. A., Guarente, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+neurons+mediate+diet-restriction-induced+longevity+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Two neurons mediate diet-restriction-induced longevity in C. elegans.</a> Nature. 447, 545-549 (2007).</li>
<li>Panowski, S. H., Wolff, S., Aguilaniu, H., Durieux, J., Dillin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PHA-4%2FFoxa+mediates+diet-restriction-induced+longevity+of+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">PHA-4/Foxa mediates diet-restriction-induced longevity of C. elegans.</a> Nature. 447, 550-555 (2007).</li>
<li>Lakowski, B., Hekimi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+caloric+restriction+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The genetics of caloric restriction in Caenorhabditis elegans.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 13091-13096 (1998).</li>
<li>Kaeberlein, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lifespan+extension+in+Caenorhabditis+elegans+by+complete+removal+of+food%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Lifespan extension in Caenorhabditis elegans by complete removal of food.</a> Aging Cell. 5, 487-494 (2006).</li>
<li>Greer, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+AMPK-FOXO+pathway+mediates+longevity+induced+by+a+novel+method+of+dietary+restriction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">An AMPK-FOXO pathway mediates longevity induced by a novel method of dietary restriction in C. elegans.</a> Curr Biol. 17, 1646-1656 (2007).</li>
</ol>

Diyet kısıtlaması (DR) ömrünü uzatır ve türlerin 5-7 memeliler dahil olmak üzere geniş bir yelpazede, çeşitli yaşa bağlı hastalıkların başlamasını geciktirmek için bilinir. Hem çevresel ve genetik manipülasyonlar C modeli DR kullanılmıştır elegans kültür solucanlar da dahil olmak üzere tanımlanmış yarı sıvı bir ortamda 8,9, 10-12 sıvı bir ortamda bakteri besin kaynağı seyreltme ve daha yavaş bir hızda 13 yaşında davranış mutantlar o linki kullanabilirsiniz. Anc...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktifin Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Carbenicillin </td><td> Duchefa Biochemie </td><td> C0109.25 </td><td> Su içinde çözülür. </td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td> Roche </td><td> 10106801001 </td><td> Su içinde çözülür. </td></tr><tr><td> Bacto-pepton </td><td> Becton Dickinson ve şirket </td><td> DF0118072 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-Tripton </td><td> Becton Dickinson ve şirket </td><td> DF0123075 </td><td></td></tr><tr><td> Bacto-maya özü </td><td> Becton Dickinson ve şirket </td><td> DF0127071 </td><td></td></tr><tr><td> Agar </td><td> Becton Dickinson ve şirket </td><td> DF00145170 </td><td></td></tr><tr><td> Steril kültür tüpünün </td><td> ABD Bilimsel </td><td> 1485-0810 </td><td></td></tr><tr><td> Spektrofotometre </td><td> Amersham Biosciences </td><td> Gene Quant pro </td><td> Amersham artık GE Healthcare parçası. </td></tr><tr><td> Diseksiyon Mikroskop </td><td> Zeiss </td><td> STEMI 2000 </td><td></td></tr><tr><td> Santrifüj </td><td> Beckman Coulter </td><td> Accuspin FR </td><td></td></tr></tbody></table>

katı plaka tabanlı diyet kısıtlama caenorhabditis elegans</em

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Yetersiz beslenme veya açlık olmadan gıda alımının azaltılması, ömrünü uzatır ve memeliler dahil olmak üzere çeşitli türlerin geniş bir yelpazede, yaşa bağlı hastalıkları, başlangıcından gecikme bilinir. Aynı zamanda vücut ağırlığı ve doğurganlık azalması yanı sıra, plazma glukozu, insülin ve IGF-1, bu hayvanlarda düşük seviyelerde neden olur. Bu tedavi genellikle diyet kısıtlaması (DR) ya da kalori kısıtlaması (CR) olarak adlandırılır. Nematod Caenorhabditis elegans yaşlanma biyoloji eğitimi için önemli bir model organizma olarak ortaya çıkmıştır. Her ikisi de çevresel ve genetik manipülasyonlar modeli DR kullanılmış olan ve C. ömrünü uzatmaya göstermiştir elegans. Ancak, C. içinde bildirilen DR çalışmaları birçok elegans yaşlanma alanında genetik çalışmaların çoğu standart katı agar petri tabak yapıldı, sıvı ortamda hayvanların propaganda yapıldı. Burada öldürülmüş bakteri içeren standart katı NGM agar tabanlı plaka kullanarak DR protokol sunuyoruz.

Burada plaka tabanlı katı diyet kısıtlaması yapmak için bir protokol mevcut<em&gt; C. elegans</em&gt; Öldürülmüş bakteri.

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans</em

Besin alımının malnütrisyon veya açlık oluşmadan azaltılmasının, yaşam süresini uzattığı ve çok çeşitli yaşa bağlı hastalıkların başlangıcını geciktirdiği bilinmektedir...

Bu prosedür, uzun ömürlülük, üreme ve metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek amacıyla, deniz zarafetindeki standart tabanlı plaka üzerinde diyet kısıtlaması uygular. Bu işlem, öncelikle besin kaynağı olarak kullanılacak bakterilerin konsantrasyonunun hassas bir şekilde ölçülmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, bakteri kültürünün uygun konsantrasyonlarda doğru şekilde seyreltilmesidir.Ardından, öldürülmüş bakteriler içeren tabanlı SDR plakaları hazırlayın. Son olarak, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonu ile SDR deneylerini kurun. Döl üretimi ve yaşam süresi ölçümlerinin sonuçları, gecikmiş ve azalmış döl üretiminin yanı sıra artmış ortalama yaşam süresini gösterebilir.Bu tekniğin AZA ortamındaki Dian gibi yöntemlere göre temel avantajı, tüm deneyin çoğu sıcak laboratuvar tarafından diyet kısıtlama deneyleri için kullanılan standart katı AGA tabanlı bir plak üzerinde gerçekleştirilecek olmasıdır ve her bir besin kaynağı olarak kullanılan bakteri suşu için ayrı kalibrasyon eğrileri oluşturulur. LB agardaki taze bir ekimden tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi seçin ve 37 °C'lik bir çalkalayıcıda gece boyunca üç mililitre sıvı LB besiyeri kültürüne inoküle edin. Gece boyunca inkübe edilen kültürün seri iki katlı dilüsyonlarını hazırlayın.Ardından, her bir dilüsyonun absorbansını spektrofotometre ile 600 nanometrede üç tekrar halinde ölçün. Bakteriyel süspansiyonları daha fazla dilüsyone ederek, her bir dilüsyondan 0,4 mililitre bakteriyel süspansiyonu 100 milimetrelik LB agar plaklarına eşit şekilde ekin ve 37 °C'de 18 ila 24 saat boyunca inkübe edin. Her örnek için mililitre başına koloni oluşturan birim sayısını hesaplamak amacıyla her plakta büyüyen bakteri kolonilerini sayın.Şimdi OD 600'ü bakteri konsantrasyonunun bir fonksiyonu olarak grafiğe dökün ve ölçülen OD 600 değerleri ile OP 50 bakteri konsantrasyonları arasındaki ilişkiyi belirlemek için doğrusal regresyon analizi gerçekleştirin. Bu yöntem için, ad lido besleme koşulunda mililitre başına 1 × 10¹¹ CFU, optimal DR besleme koşulunda ise mililitre başına 1 × 10⁸ CFU bakteri konsantrasyonu kullanılır. Bununla birlikte, tam bir doz bağımlı ilişki kurmak için dört ila altı farklı bakteri konsantrasyonuna ihtiyaç duyulabilir.SDR ve yanıtları için. Tek bir e coli OP 50 bakteri kolonisi ile üç mililitre sıvı LB besiyerinde, 37 °C sarsıntılı inkübatörde altı ila sekiz saat boyunca kültüre ederek bir inokülüm hazırlayın. OP 50 kültürünü, 500 mililitre LB besiyeri içeren yeni bir erlene aktarın ve gerekirse bakterilerin doygunluğa ulaşması için gece boyunca büyütün.OD 600 değerinde absorbans ölçümü için OP 50 kültürünün uygun seyreltmesini hazırlayın. Bakteri konsantrasyonunu belirlemek için bakterileri 1500 Gs'de 20 dakika boyunca santrifüj ederek çöktürün. Süpernatantı uzaklaştırın ve bakterileri mililitrede 1 × 10¹² CFU konsantrasyonuna gelecek şekilde yeniden süspande edin.Şimdi, mililitre başına 1 × 10¹² ile 1 × 10⁷ CFU arasında değişen altı farklı konsantrasyonda 10 mililitrelik bakteri kültürleri hazırlayın. 60 milimetrelik katılaştırılmış N GM plaklarının merkezine pipetle 0,2 mililitre bakteri kültürü ekleyin. Pipet ucunun plaka yüzeyine temas etmesinden kaçının; çünkü yüzeydeki çizikler, solucanların agar tabakasına gömülmesine neden olur.Plakaları bir saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin. Ardından, bakterilerin büyümesini durdurmak için her plağa 10 µL 100 mg/mL carbonic soin ve 10 µL 50 mg/mL can mycin uygulayın. Farklı antibiyotik konsantrasyonlarıyla bakterileri öldürdüğünüz plakları, gelecekte kullanmak üzere bir aya kadar 4 °C'de saklayın.Tüm bitki için tercihen aynı partiden olmak üzere yeterli miktarda plaka hazırlanması ve saklanması önemlidir. Bakterilerin canlılığını doğrulamak için en az bir ila iki gün önceden deney yapın. SDR plakalarından bir miktar bakteri kazıyın ve bunu karbonik, sein ve antimisin içeren boş bir N GM plakasına yayın.Plakayı altı ila sekiz saat boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin ve bakteriyel büyüme olmadığını doğrulayın. Yaşam süresi analizi ve döl üretim profillemesi gibi SDR ile ilgili çalışmaların çoğunda, yaşları senkronize edilmiş bir solucan popülasyonunun hazırlanması esastır. 20 ila 30 adet reprodüktif olarak aktif yetişkini birkaç standart NGM plağına aktarmak için platin bir solucan toplama iğnesi kullanın.OP 50 ile. Deneyler için gereken yumurta sayısına bağlı olarak, daha fazla yetişkin gerekebilir. Yumurta bırakılmasına izin vermek için plakaları 20 °C'de dört saat bekletin.Yetişkinleri plakadan çıkarın ve plakaları yumurtalar açısından görsel olarak inceleyin. Yavruların geç L4 birincil yetişkin evresine gelmelerini sağlamak için plakaları 20 °C'de inkübe etmeye devam edin. 20 °C'de N2 yabani tip solucanlar için bu işlem genellikle üç gün sürer.Ömür analizi için. Diyet kısıtlamasını başlatmak amacıyla 10 ila 12 günlük bir yetişkin solucanı bir SDR plakasına aktarın. Yeterli istatistiksel güce ulaşmak için, her SDR koşulu için toplam 60 ila 100 solucan kullanın.Tüm solucanlar ölene kadar her iki ila üç günde bir her bir solucanın canlılığını puanlayın. Önemli bir nokta olarak, açlığı önlemek için solucanları gün aşırı taze SDR plaklarına aktarın. Bu kalibrasyon eğrisi, OP 50 konsantrasyonunu OD 600 ile ilişkili olarak grafikler.Lineer regresyon analizi ile elde edilen denklem, gelecekteki tüm OP 50 bakteri konsantrasyonu hesaplamaları için kullanılabilir. Bu çalışma, kronik SDR tedavilerinin farklı solucan suşlarının ortalama yaşam süresi üzerindeki etkisini, vahşi tip solucanların SDR'ye verdiği normal doz bağımlı yanıtla karşılaştırarak incelemektedir. SDR'nin yaşam süresi üzerindeki etkisi, DR iki aşırı ekspresyonu ile kısmen baskılanırken, DAF 16 MU 86 mutasyonunun SDR kaynaklı yaşam süresi uzaması üzerinde hiçbir etkisi yoktur.Bu videoyu izledikten sonra, sea elegance'daki standart AGA tabanlı oyunda Dian işleminin nasıl gerçekleştirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

solid-plate-based-dietary-restriction-in-caenorhabditis-elegans

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Temel<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Yöntem: Senkronizasyon ve Gözlem

&lt;em&gt; Caenorhabditis elegan &lt;/ em&gt; geliştirme ve fizyolojisi çok-doymamış yağlı asitlerin fonksiyonlarını keşfetmek için uygun bir modeldir. Bu protokol &lt;em&gt; C tamamlayan etkili bir yöntem tarif elegans &lt;/ em&gt; çoklu doymamış yağ asitleri ile diyet.

Çoklu doymamış yağ asitlerinin Diyet takviyesi<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

Burada, organizmanın iyi beslenmiş bir beslenme durumundan aç kalmış beslenme durumuna geçmesiyle bakırdan kaçınma davranışındaki ve ortak bir besin kaynağını bulma yeteneğini değerlendirmek için tasarlanmış Caenorhabditis elegans spesifik bir analiz sunuyoruz.

bir<emCaenorhabditis elegans</emBeslenme Durumuna Dayalı Bakır Kaçınma Deneyi

Burada, bir çerçeve geniş menzilli diyet kısıtlaması gen ekspresyonu ve ömrü ile ilgili mevcut. Biz iletişim kuralları bu paradigma altında gen ekspresyonu kantitatif görüntüleme ve geniş menzilli diyet kısıtlaması için açıklar. Daha fazla bilgi işleme özellikleri genetik devrelerin temel gıda algılamalı içinde söz konusu ortaya çıkarmak için hesaplama analizleri anahat.

C. elegans gen ifade seviyeleri sırasında ömrü modülasyon altında geniş menzilli diyet kısıtlama tarafından kodlanmış bilginin bir miktar

Bu iletişim kuralı bir yöntem Caenorhabditis elegans büyük ölçekli ekimi için katı medyada açıklar. Sıvı kültür alternatif, bu protokol parametreleri farklı ölçeklerde plaka tabanlı ekilen almak sağlanır. Bu sonuçlar karşılaştırılabilir sıvı ve katı Medya kültürü arasındaki morfolojik ve metabolik farklar ihmal olarak artırır.

Large-scale tarımı plaka tabanlı Caenorhabditis elegans: diyabet metabolik değişiklikler çalışma için numune hazırlama

Proteostatik düşüş, nörodejeneratif hastalıkların başlangıcını kolaylaştıran yaşlanmanın ayırt edici bir özelliğidir. İki farklı Caenorhabditis elegans dokularındaki proteostazları, floresan bir muhabire kaynaşmış poliglutamin tekrarlarının heterolog ifadesiyle ölçülebilir bir şekilde ölçmek için bir protokol özetliyoruz. Bu model proteostazın hızlı in vivo genetik analizine izin verir.

Caenorhabditis eleganlarında Dokuya Özgü Proteostatik Düşüşün Ölçülmesi

Genetik olarak çekilebilir nematod Caenorhabditis elegans, ilaç keşfi için basit ve ucuz bir model olarak kullanılabilir. Burada, RAS ve EGFR proteinlerinin aşağı akış sinyalini engelleyen antikanser terapötiklerini tanımlamak için bir protokol açıklanmıştır.

Caenorhabditis elegans kullanılarak EGFR ve RAS inhibitörlerinin tanımlanması

Aşağıdaki protokol, proteostazdaki değişikliklerin bir değerlendirmesi olarak poliglutamin agregalarını ölçmek için solucan kültürleme, floresan görüntüleme ve otomatik görüntü işleme için yüksek verimli bir iş akışının geliştirilmesini ve optimizasyonunu açıklamaktadır.

Caenorhabditis elegans'ta Agrega Niceliğinin Otomatikleştirilmesi

Bu, C. elegans gonad diseksiyonu ve ardından antikor boyama yoluyla immünofloresan için germline örnekleri üreten donma çatlağı veya DNA'yı görselleştirmek için basit DAPI boyama için yaygın olarak kullanılan bir yöntemdir. Bu protokol, bir araştırma laboratuvarında ve ders tabanlı bir lisans araştırma deneyiminde lisans öğrencileri için başarılı olmuştur.

C. elegans · İmmünofloresan ve DAPI Boyama için Gonad Diseksiyonu ve Dondurucu Çatlak

Bu protokol, sıvı kültürdeki bakterilerin klirensinin ölçülmesine dayalı olarak Caenorhabditis elegans besleme hızını ölçmek için bir testi tanımlar.

Bakteriyel Klerensi Ölçerek Caenorhabditis elegans'ta Gıda Alımının Ölçülmesi

Öğrenin, Caenorhabditis elegans'ta katı plaka tabanlı diyet kısıtlama protokolünü. Bu yöntem, öldürülmüş bakteri kullanarak yaşam süresi, üreme ve metabolizma üzerindeki etkileri incelemek için geliştirilmiştir.

Katı Plaka tabanlı Diyet Kısıtlama Caenorhabditis elegans

Daha fazla video keşfet