Name: Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-02T17:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 1 s
Description: Öğrenin farelerde cerrahi olmayan intratrakeal damlatma yöntemiyle akciğer bağışıklık hücrelerini akış sitometri ile analiz etmeyi. Bu teknik, test materyallerinin akciğerlere yönlendirilmiş teslimini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Işleminden önce, hazırlamak ve aşağıdaki öğeleri toplamak <ol><li> Lütfen işlem sırasında fare dizginlemek için tahta bir platform oluşturmak için) Şekil 1a resme bakın) ve 1b. </li><li> Sindirim karışımı HBSS + 1.25mg/ml kollajenaz TypeIV veya 2.5 mg / ml kollajenaz D - lenf düğümleri </li><li> Akciğerler için Sindirim karışımı - HBSS + 1 mg / ml kollajenaz </li><li> LDLNs görselleştirmek için intraperitoneal PBS lateks boncuk (1:20) sulandırınız </li></ol> Not: LDLNs bulmak için küçük ve sert. Onları bulmak için öğrenmek için, fare içine kırmızı floresan lateks boncuk ip seyreltilmiş 01:20 200μl enjekte edilir. Periton bu LDLNs 8 akıtır. 24 HPI, yukarıda anlatıldığı gibi fare torasik kavite maruz kalmaktadır. LDLNs periton boşluğuna drene boncuk pembe görünür. <ol start="5"><li> Kırmızı Kan Hücresi (RBC) Lizis Tampon - 0.15m NH 4 Cl, 10mM KHCO 3, 1L dH 2 0 0.1 mM Na 2 EDTA. 7,2-7,4 pH ayarlama ve oda sıcaklığında saklayın. </li><li> 100μm 70μm veya hücre süzgecinden </li><li> Stok çözelti 0,5 M EDTA, pH = 8.0 </li><li> CaCl 2 ve MgCl 2 olmadan HBSS </li><li> Makas ve künt uçlu forseps </li><li> Larengoskop </li><li> Gavaj iğne (22 gauge) bir açıyla bükülmüş (Şekil 2) </li><li> Strafor yönetim kurulu ve fare yaymak için pimleri </li><li> En pan dengesi </li><li> Anilin Mavi Çözüm - H 2 O 10mg/ml </li></ol> Not: Biz bu enjeksiyon tekniği, bu gösteri için çözümünü kullanıyor olacak. 2. Fare anestezi hazırlanması ve yönetimi <ol><li> Son konsantrasyonları sırasıyla 2mg/ml ve 10mg/ml böylece steril PBS Xylazine ve Ketamin bir karışım hazırlayın. </li><li> En pan dengesi üzerinde fare tartılır. </li><li> Her fare için gerekli doz hesaplayın. Hazırlanan karışım uygun hacim kullanarak Xylazine (2-4 mg / kg) ve Ketamin (70-80 mg / kg) vücut ağırlığı dozu ve intaperitoneally enjekte. Her fare suşu anestezik optimizasyonu gerekebilir. Çok anestezi alan Fare inokulum Ciğerlere aşılandığı sonra ölümcül olabilir düşük bir solunum hızı olabilir. </li><li> 3-5 dakika sonra, anestezik etkileri için fare gözlemliyoruz. Fare tam anestezi olduğunu onaylamak için aşağıdaki belirtiler olup olmadığını kontrol edin: <ol><li> Solunum hızını yavaşlatmak gerekir. </li><li> Boyun tarafından yakalandı fare kol germek gerekir. </li><li> Arka bacaklarda uyarılır herhangi bir yanıt olmamalıdır. Bu kriterleri yerine getirilmemesi halinde, birkaç dakika bekleyin ve bir sonraki adıma geçmeden önce tekrar kontrol edin. </li></ol></li></ol> 3. Intratrakeal enjeksiyon <ol><li> Innoculum 50μl tuzlu su hazırlayın. Innoculum, steril bir bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış bir 1ml şırınga doldurun. Şırınga sıvı akciğer aşılamış olduğu sağlamak için, innoculum arkasında bir 100μl hava cepli yüklenmiş olması gerekir. </li><li> Fare, tel üzerinde kesici dişler tarafından asılı açılı bir tahta platform üzerinde yerleştirin ve yavaşça kurdelenin bir parçasını bir yere dizginlemek. </li><li> Laringoskop sol elinizle açın (sağ elle) ve künt uçlu forseps, bir çift kapmak. Laringoskop ucu ve forseps, ağzı hafifçe açık gözetlemek için kullanın. </li><li> Forseps, dil çekin ve yan tutun. Ağız arkasına doğru laringoskop bıçak Kılavuzu. Laringoskop trakeanın açılması görene kadar 90 ° açıyla çok hafifçe basılı tutun. Laringoskop bir yerde tutun. Ağzından dil çekerek, herhangi bir doku zedelenmelerinde oluşur bu nedenle bu nazikçe yapılmalıdır zaman dikkat edilmelidir. </li><li> Iğne bend ön kesici dişler kadar diğer elinizle, sağ elleri ile bükülmüş gavaj iğne ile donatılmış innoculum içeren 1 ml şırınga, iğne ve trakea içine eklemek. Innoculum sunmak için eşit pistonu itin. Innoculum kabarcık olmamalı. Mümkün olan en kısa sürede iğne trakea dışarı çekin. Fare boğmak ve trakea, çok uzun süre bloke ise ölecektir. Innoculum Ciğerlere inhale izin vermek için birkaç saniye için fareyi dik tutun. </li><li> Platformun fare çıkarın ve bir ısıtma lambası yakın yerleştirin. Doğrudan ısı altında uzun süre farelere bırakmayın. Fare prosedürü (suşları dayalı iyileşme süresi değişebilir) sonra 30 dakika içinde tamamen uyanık olmalıdır. Fareler bu süre içinde özenle gözlenen ve çok sıcak veya çok soğuk almak için izin verilmemeli, bu da ölüme yol açan solunum sıkıntısı içine fareler koyabilirsiniz. </li></ol> 4. Hasat ve işleme flow sitometri Akciğer drenaj lenf düğümleri ve akciğerler<ol><li> AVMA ötenazi yönergelerine göre istediğiniz yöntemi kullanarak fareleri Kurban. Bu bireysel hasat sonuçları bağlı olarak değişebilir. Pentobarbital sodyum ölümcül bir İdaresi uygun bir ötenazi yöntemi bir örnektir. Biz CO 2 ötenazi negatif akciğer etkileri görmedim. </li><li> Diseksiyonu kurulu kollar ve bacaklar Pin. Makas ile ventral tarafında ortasında boyunca bir kesi olun. Cildi nazikçe çekin ve göğüs duvarındaki kasların maruz. </li><li> Torasik duvarı kasları ile karın içi organların maruz kesiler olun. </li><li> Forseps ve delinme diyafram ile sternum ucu tutun. Göğüs kafesinin iki yanında diyafram kesin. </li><li> Diseksiyon levha yüzeyine paralel makas, her iki tarafta dorso-ventral hattı boyunca göğüs boşluğu kesti. </li><li> Göğüs kafesinin hafifçe yukarı kaldırın. Timus altında, sadece, kalbin sağ tarafında iki lenf düğümleri için bakın. Biraz daha büyük üçüncü lenf nodu trakea dik çalışan küçük bir arteryel kan damarı altında yer almaktadır. Hasat lenf düğümleri, lenf nodu sindirim karışımı içine 1 ml. </li><li> Lenf düğümleri hasat sonra, forseps bir çift kalp tutun ve başka bir ile akciğerlere kapmak. 6 plaka buz PBS 3ml içine Hasat akciğerler. </li><li> , Akciğer lobları ayrı bir PBS aspirat ve loblar forseps ve makas kullanarak küçük parçalar halinde doğrayın. 3ml akciğerler için sindirim karışımı ekleyin. Bu adım sırasında buz üzerinde 6 plaka tutun. </li><li> 37 at, 30 dk 25-30 dk ve akciğerler, lenf düğümleri inkübe ° C. Buz üzerinde reaksiyon ve durdurmak için sindirim karışımların her 10mM nihai konsantrasyonu EDTA ekleyin. </li><li> 3ml bir şırınga kullanarak, bir 18GA iğne yoluyla akciğerlere parçaları 3 kez geçmek. Mash bir 1ml şırınga pistonu arka uç kullanarak 70-100μm hücre süzgeçler ile akciğerler ve LN parçaları. HBSS, 10ml hücre süzgeçler yıkayın olmadan Ca 2 + ve Mg 2 +. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. </li><li> 5 ml eritrosit lizis tamponu pelletini tekrar ve oda sıcaklığında 3 dakika inkübe edin. Ca 2 olmadan HBSS, 10ml + ve Mg 2 + lizis gidermek için. 5 dakika boyunca 500 xg'de santrifüjleyin. Sırasıyla akciğer ve LDLN tek hücre süspansiyonları 10ml ve 5ml kadar getirin. Trypan mavisiyle boyama canlı hücreler kullanarak bir hemasitometre güvenin. Hücreler flow sitometri leke hazır. 1 akciğer lob flow sitometri için yeterli olabilir. Diğer loblar histoloji için sitokinler veya doku için homojenatlarında gibi aynı fare içindeki diğer deneysel sorular için kullanılabilir. </li></ol> 5. Temsilcisi Sonuçlar: Hemen enjeksiyonu takiben akciğerlerde en az gelişmiş ülkeler ve alveoler makrofaj akciğerlerde alveolar alanlarda antijen elde. Şekil 3 CD11c + (en az gelişmiş ülkelere ve alveoler makrofajlar ifade) yüzdesi floresan etiketli Bacillus anthracis sporları için pozitif hücreler, 30 dakika yazılan bu enjeksiyon gösterir. Bu zamanda, akciğer tek hücre süspansiyonu CD45 + CD11c + hücreler ~% 15.9, Bacillus anthracis sporları (Şekil 3, alt paneller) barındırmaktaydı . Akciğerlerde CD11c + hücreler daha fazla karakterizasyonu için, Kim ve Braciale 4 bakın. Floresan ile işaretlenmiş boncuk rutin LDLNs 9 partikül antijenlerin kaçakçılığı değerlendirmek için kullanılır. Akciğerlerden LDLNs taşıma değerlendirmek için, floresan lateks boncuk LPS ve LDLNs 24 HPI incelendi ile enjekte edildi. LDLNs CD11c hi hücrelerin yaklaşık% 4 24hpi (Şekil 4) floresan boncuk barındırmaktaydı. Bu temsilcisi deneyler, bu protokol verimli LDLNs akciğerler ve bunları daha sonra trafik inhale partikül antijenleri elde hücreleri izlemek için kullanılabilir olduğunu göstermektedir. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. ) Bu enjeksiyon sırasında fareler frenleyici Ahşap platform tahta blok bir açıyla kesilmiş ve metal çubuklar, önden görünüm Şekil 1a'da takıldı) ve yan görünüm rakam 1b. Küçük bir tel parçası fare ön kesici dişler demirlemek için metal çubuğun etrafına sarılmış. Bir parça şerit, işlem sırasında bir yerde tutmak için fareyi etrafında kravat platforma bağlanmıştır. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2. Bu enjeksiyon için sonda iğne sonda bir iğne (sağ) bu enjeksiyon için ~ 135 ° (sol) bir açıyla bükülmüş. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Bacillus anthracis ifade enjekte GFP (Sterne-p6GFP), 5 saate yazılan meydan liman akciğerlerde CD11c + hücrelerinin yüzdesi. AJ fareler 1x ile mücadele5 saate yazılan enfeksiyonu 10 8 GFP-Bacillus anthracis sporları ve akciğerler incelendi. Nokta araziler CD11c'nin yüzdesi + Bacillus anthracis için pozitif olan akciğer hücreleri. <img src="/files/ftp_upload/2702/2702fig4.jpg" alt="Şekil 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 4"> Şekil 4. I. T enjeksiyonu takiben 24 saat drenaj lenf düğümleri, akciğer, floresan boncuk Algılama (sarı / yeşil) . AJ fareler ve LDLNs 24hpi incelendi 10μg LPS (sağ panel) ile PBS (sol panel) veya 5x10 9 Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm) ya verildi. Temsilcisi nokta araziler, liman floresan boncuklar boş bir kanal karşı çizilen LDLNs CD11c hi hücrelerinin yüzdesini gösteriyor .

<ol><li>Grayson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+for+lung+dendritic+cell+maturation+and+migration+during+respiratory+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Controls for lung dendritic cell maturation and migration during respiratory viral infection.</a> J Immunol. 179, 1438-1438 (2007).</li>
<li>GeurtsvanKessel, C. H., Lambrecht, B. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Division+of+labor+between+dendritic+cell+subsets+of+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Division of labor between dendritic cell subsets of the lung.</a> Mucosal Immunol. 1, 442-442 (2008).</li>
<li>Bar-Haim, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interrelationship+between+dendritic+cell+trafficking+and+Francisella+tularensis+dissemination+following+airway+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Interrelationship between dendritic cell trafficking and Francisella tularensis dissemination following airway infection.</a> PLoS Pathog. 4, e1000211-e1000211 (2008).</li>
<li>Kim, T. S., Braciale, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+dendritic+cell+subsets+differ+in+their+capacity+to+support+the+induction+of+virus-specific+cytotoxic+CD8%2B+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Respiratory dendritic cell subsets differ in their capacity to support the induction of virus-specific cytotoxic CD8+ T cell responses.</a> PLoS One. 4, e4204-e4204 (2009).</li>
<li>Bakocevic, N., Worbs, T., Davalos-Misslitz, A., Forster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell-dendritic+cell+interaction+dynamics+during+the+induction+of+respiratory+tolerance+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">T cell-dendritic cell interaction dynamics during the induction of respiratory tolerance and immunity.</a> J Immunol. 184, 1317-1317 (2010).</li>
<li>Thomas, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+particle+size+on+the+pathology+and+efficacy+of+vaccination+in+a+murine+model+of+inhalational+anthrax%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Influence of particle size on the pathology and efficacy of vaccination in a murine model of inhalational anthrax.</a> J Med Microbiol. , (2010).</li>
<li>Kiyono, H., Fukuyama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NALT-+versus+Peyer%27s-patch-mediated+mucosal+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">NALT- versus Peyer's-patch-mediated mucosal immunity.</a> Nat Rev Immunol. 4, 699-699 (2004).</li>
<li>Parungo, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphatic+drainage+of+the+peritoneal+space%3A+a+pattern+dependent+on+bowel+lymphatics%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lymphatic drainage of the peritoneal space: a pattern dependent on bowel lymphatics.</a> Ann Surg Oncol. 14, 286-286 (2007).</li>
<li>Jakubzick, C., Helft, J., Kaplan, T. J., Randolph, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+methods+to+study+pulmonary+dendritic+cell+migration+reveals+distinct+capacities+of+DC+subsets+to+acquire+soluble+versus+particulate+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of methods to study pulmonary dendritic cell migration reveals distinct capacities of DC subsets to acquire soluble versus particulate antigen.</a> J Immunol Methods. 337, 121-121 (2008).</li>
<li>Higgins, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+levels+of+M-CSF+and+GM-CSF+influence+the+specific+generation+of+macrophage+populations+during+infection+with+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Relative levels of M-CSF and GM-CSF influence the specific generation of macrophage populations during infection with Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 180, 4892-4892 (2008).</li>
<li>Kool, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alum+adjuvant+boosts+adaptive+immunity+by+inducing+uric+acid+and+activating+inflammatory+dendritic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Alum adjuvant boosts adaptive immunity by inducing uric acid and activating inflammatory dendritic cells.</a> J Exp Med. 205, 869-869 (2008).</li>
<li>Costa, D. L., Lehmann, J. R., Harold, W. M., Drew, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transoral+tracheal+intubation+of+rodents+using+a+fiberoptic+laryngoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+Sci%22%5BJournal%5D)">Transoral tracheal intubation of rodents using a fiberoptic laryngoscope.</a> Lab Anim Sci. 36, 256-256 (1986).</li>
<li>Takahashi, S., Patrick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+lymphatic+drainage+to+individual+thoracic+and+cervical+lymph+nodes+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Patterns of lymphatic drainage to individual thoracic and cervical lymph nodes in the rat.</a> Lab Anim. 21, 31-31 (1987).</li>
<li>Broeck, W. V. anden, Derore, A., Simoens, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomy+and+nomenclature+of+murine+lymph+nodes%3A+Descriptive+study+and+nomenclatory+standardization+in+BALB%2FcAnNCrl+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Anatomy and nomenclature of murine lymph nodes: Descriptive study and nomenclatory standardization in BALB/cAnNCrl mice.</a> J Immunol Methods. 312, 12-12 (2006).</li>
</ol>

Bacillus anthracis sporları akciğerlerden LDLNs ticareti incelemek için bu protokol kullanılmaktadır. Benzer uygulamalar için, akciğerlere teslim parçacıkların sayısını dikkatli bir şekilde enjekte edilen malzeme akış sitometri LDLNs tespit edilebilir, böylece seçilmiş olmalıdır. Biz de başarıyla hücreleri ve floresan etiketli antikorlar kullanarak belirli bir akciğer hücre popülasyonlarının etiketleme evlatlık transferi için bu yöntemi kullanmıştır. Ayrıca, bu yöntem rutin doğrudan akciğerler 10 içi...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktifin Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog numarası </th><th> Yorumlar (isteğe bağlı) </th></tr><tr><td> 70μm Hücre stariner </td><td> BD </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Anilin Mavi </td><td> Balıkçı </td><td> A967-25 </td><td></td></tr><tr><td> Hayvan Besleme iğne </td><td> Popper ve Sons Inc. </td><td> 7920 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz </td><td> Sigma </td><td> C2139 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz TypeIV </td><td> Worthington </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz D </td><td> Roche </td><td> 11088974103 </td><td></td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Invitrogen </td><td> 14190 </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite YG Mikroküreler (0.5μm) </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 17152 </td><td></td></tr><tr><td> Kalsiyum klorür ve magnezyum klorür olmadan HBSS </td><td> Invitrogen </td><td> 14170 </td><td></td></tr><tr><td> Ketamin HCl (100mg/ml) </td><td> Hospira Inc. </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Laringoskop Blade </td><td> PennCentury, Inc. </td><td> Model LS-1 için </td><td> Bakın <a href="http://www.penncentury.com">www.penncentury.com</a> </td></tr><tr><td> Hafif Fiber Optik Laringoskop </td><td> WelchAllyn </td><td> 80814 </td><td></td></tr><tr><td> Kırmızı Floresan Boncuk (0.5μm) </td><td> Invitrogen </td><td> F8812 </td><td> Ip enjeksiyon için </td></tr><tr><td> Xylazine (100mg/ml) </td><td> Lloyd Laboratuvarları </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

akış sitometri akciğerler ve akciğer boşaltma lenf düğümleri analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Non-surgical Intratracheal Instillation of Mice with Analysis of Lungs and Lung Draining Lymph Nodes by Flow Cytometry

, Alveoler makrofaj ve akciğer dendritik hücreler (LDC) olarak fagositik hücrelerin sürekli olarak akciğerlerde alveoler boşluklar antijenleri örnek. En az gelişmiş ülkelere, özellikle de akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) T hücreleri başlatılması için uygun bir immün yanıt immünojenleri 1,2 çeşitli inhale antijenlere mevcut. Göç etmek bilinmektedir Farelerde akciğer ve havadaki antijenleri arasındaki etkileşimler modeli, antijenler intratrakeal 5 veya aerosoller 6 olarak, intranazal 1,3,4 idare edilebilir. Her güzergah tarafından teslim ayrı teknik beceri ve bir deney tasarımı önce dikkate alınması gereken kısıtlamalar içerir. Örneğin akciğerlerin ve üst solunum yolu, burun içi ve aerosol maruz antijenleri sağlar. Dolayısıyla antijenler potansiyel sonuçların yorumlanması komplike, burun ilişkili lenfoid doku (NALT) 7 erişebilirsiniz. Buna ek olarak, yutkunma, hapşırma ve farenin solunum oranı da teslim edilen dozlar tutarsızlıklara yol açabilir. Üst solunum yolu tutulumu bazı çalışmalar için tercih edilebilir olsa da, özellikle akciğerlerde başlatılan olaylara odaklanan deneyler karmaşık hale getirebilir. Bu ortamda, doğrudan ciğerlerine test materyalleri sunar ve NALT atlar intratrakeal () yol tercih edilir. Birçok bu enjeksiyon protokolleri oral kavite veya akciğerlere erişmek için trakea cerrahi maruz kalma yoluyla trakea ya kör entübasyon içerir. Burada, biz bu instilasyon için basit, tutarlı, cerrahi olmayan bir yöntem açıklanmaktadır. Trakeanın açılması bir laringoskop kullanılarak görüntülendi ve kıvrık bir sonda iğne sonra innoculum teslim trakea doğrudan eklenir. Ayrıca, hasat ve LDLNs ve akciğerler, flow sitometri ile antijen ticareti analiz için işlenmesi için prosedürler açıklanmaktadır.

Biz anestezi farelerin trakea yoluyla ciğerlerine test malzemelerin cerrahi olmayan teslimat göstermektedir. Bu yöntem, bakteriyel ve viral patojenler, sitokinler, antikorlar, boncuk, kimyasallar, ya da boyalar akciğer maruz izin verir. Daha hasat ve flow sitometri akciğer ve akciğer drenaj lenf düğümleri (LDLNs) işlenmesi açıklanmaktadır.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Alveolar makrofajlar ve akciğer dendritik hücreleri (LDC'ler) gibi fagositik hücreler, akciğerlerdeki alveolar boşluklardan sürekli olarak antijen örneklemesi yapar. LDC'ler, ...

Bu prosedürün genel amacı, bir gavaj iğnesi kullanarak farelerin akciğerlerine cerrahi olmayan bir yöntemle test materyali aktarmak ve ardından akciğerleri ile akciğer drenaj lenf düğümlerini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle anestezi uygulanmış bir farenin trakeasına aydınlatmalı bir laringoskop ve bükülmüş bir gavaj iğnesinin yerleştirilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, test materyali laringoskop ve gavaj iğnesi aracılığıyla hayvanın akciğerlerine instile edilir.Ardından, akciğerler ve drenaj lenf düğümleri çıkarılır. Son olarak, akciğerler ve lenf düğümleri tek hücreli süspansiyonlar haline getirilir. Nihayetinde bu yöntem, test materyalinin akciğer bağışıklık hücreleriyle olan etkileşiminin ve hücrelerin akciğer drenaj lenf düğümlerine göçünün akış sitometrik analizini kolaylaştırır.Bu tekniğin intranazal ve aerosolize maruziyet gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, test materyalinin nazal ilişkili lenfoid doku baypas edilerek doğrudan akciğerlere iletilmesine olanak tanımasıdır. Ayrıca, trakeal instillasyon için cerrahi operasyon geçiren sıçanlarla karşılaştırıldığında uygulanması oldukça basittir. Prosedürü, Richie laboratuvarında doktora sonrası araştırmacı olan Elizabeth Enti ve Lens laboratuvarında lisansüstü öğrencisi olan Manji gösterecek.Fareyi anestezi ettikten sonra, inokülumu 50 µL serum fizyolojik içerisinde hazırlayın. Steril eğri bir gavaj iğnesi takılı olan bir mililitrelik şırıngayı inokulumla doldurun. Sıvının tamamının akciğere iletildiğinden emin olmak için şırıngaya, inokulumun arkasında 100 µL'lik bir hava boşluğu ekleyin.Fareyi, kesici dişleriyle telden asılı duracak şekilde açılı ahşap platformun üzerine yerleştirin ve bir şerit parçasıyla nazikçe sabitleyin. Ardından, bir elinizle laringoskopu açın ve diğer elinizle küt uçlu pensetle alın. Ağzı nazikçe aralamak için laringoskopun ucunu ve penseti kullanın.Dili dışarı çekin ve yan tarafta tutun. Laringoskop bıçağını ağzın arka kısmına doğru yönlendirin. Trake açıklığı görünene kadar laringoskopu 90 derecelik bir açıyla çok nazikçe aşağı bastırın.Laringoskop bir elle sabit tutulurken, diğer elle inokülüm içeren eğri gavaj iğnesi takılı bir mililitrelik şırınga alın. İğneyi, iğnedeki eğim ön kesici dişlerin hizasına gelene kadar trakeaya yerleştirin. İnokülümü hava kabarcığı oluşturmadan iletmek için pistonu eşit şekilde itin.İğneyi mümkün olan en kısa sürede trakeadan geri çekin. İnokülümün akciğerlere solunmasını sağlamak için fareyi birkaç saniye dik tutun. Fareyi bir ısıtıcı lambanın yakınına yerleştirin ve uyanmasını bekleyin.Ötanazi işleminin ardından farenin kol ve bacaklarını bir diseksiyon tahtasına iğneleyin. Makasla ventral tarafın ortası boyunca bir insizyon yapın. Deriyi nazikçe çekerek peritonu açığa çıkarın.Karın organlarını açığa çıkarmak için peritonyum üzerinde insizyonlar yapın. Sternumun ucunu pens ile tutun ve diyaframı makasla delin. Diyaframı, makası diseksiyon tahtası yüzeyine paralel tutarak göğüs kafesinin yanları boyunca kesin.Toraks boşluğunu, her iki tarafta dorsoventral hat boyunca hafifçe kesin. Kalbin sağ tarafındaki göğüs kafesini yukarı kaldırın. Timusun hemen altında iki lenf nodu arayın.Trakeaya dik uzanan küçük bir arteriyel kan damarının altında, biraz daha büyük olan üçüncü bir lenf düğümü bulunur. Lenf düğümlerini bir mililitre lenf düğümü sindirim solüsyonu içine toplayın, karıştırın ve buz üzerine yerleştirin. Lenf düğümlerini topladıktan sonra, akciğerleri altı kuyucuklu bir plakaya toplayın.Altı kuyucuklu plakayı buz üzerinde tutarak PBS'yi aspire edin ve lobları forseps ve makas kullanarak küçük parçalara bölün. Her bir lenf düğümünü 26 gauge bir iğne ile sabit tutun ve ikinci bir 26 gauge iğne ile parçalara ayırın. Tüm hücrelerin serbest kalmasını sağlamak için, akciğerler için üç mililitre ve lenf düğümleri için bir mililitre sindirim karışımı ekleyin.Lenf nodlarını 25 ila 30 dakika, akciğerleri ise 37 °C'de 30 dakika inkübe ettikten sonra, reaksiyonu durdurmak için her bir sindirim karışımına son konsantrasyonu 10 mM olacak şekilde EDTA ekleyin ve ardından karışımları buz üzerine yerleştirin. Üç mL'lik bir şırınga kullanarak, akciğer parçalarını 18 gauge bir iğneden geçirin. Akciğer ve lenf nodu parçalarını 70 ila 100 µm'lik hücre süzgeçlerinden üç kez geçecek şekilde ezin.Bir mililitrelik şırınga pistonunun arka ucunu kullanarak, hücre süzgeçlerini kalsiyum ve magnezyum içermeyen 10 mililitre HBSS ile yıkayın. Hücre örneklerini 4 °C'de, beş dakika boyunca 500 ×g'de santrifüjleyin. Pelletleri beş mililitre eritrosit lizis tamponu ile yeniden süspanse edin ve üç dakika boyunca inkübe edin.Oda sıcaklığında, lizisi durdurmak için 10 mililitre kalsiyum ve magnezyum içermeyen HBSS ekleyin ve örnekleri 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Akciğer ve akciğer drenaj lenf nodu tek hücre süspansiyonlarının hacimlerini sırasıyla 10 mililitre ve 5 mililitreye tamamlayın. Hücreleri saymak için bir hemositometrede tripan mavisi dışlama yöntemini kullanın.Bu iki şekilde, AJ fareleri 1 × 10⁸ basillas rassis sporu ile enfekte edilmiş ve enfeksiyondan 30 dakika sonra akciğerler akış sitometrisi ile analiz edilmiştir. Bu nokta grafikleri, kapılama stratejisini göstermektedir. Bu paneller, CD 45 pozitif CD 11 C pozitif akciğer hücrelerinin ne kadarlık bir yüzdesinin bacillus anthrax sporları için pozitif olduğunu göstermektedir.Bu şekilde, AJ farelerine intratrakeal enjeksiyon yapılmış ve ardından akciğer drenaj lenf düğümleri analiz edilmiştir. Temsili nokta grafikleri, boş bir kanala karşı çizilen ve floresan boncuklar içeren akciğer drenaj lenf düğümlerindeki CD 11 C yüksek hücrelerin yüzdesini göstermektedir. Sol panel PBS enjekte edilen farelerin sonuçlarını, sağ panel ise 10 µg LPS içeren 5 × 10⁹ parlak sarı yeşil mikroküre enjekte edilen farelerin sonuçlarını göstermektedir.Bu yöntem, akciğerlerde spesifik olarak hangi olayların başladığı ve inhale edilen antijenlerin akciğerlerden drenaj lenf düğümlerine nasıl taşındığı gibi alandaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

non-surgical-intratracheal-instillation-mice-with-analysis-lungs-lung

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Insanlarda akciğer hastalıklarının durumunu taklit eden bir modelinin kullanılması, belirli bir hastalığın patofizyolojisi ve / veya etyolojisinin araştırılması için ve terapötik müdahale geliştirmek için çok önemlidir. Burada doğrudan fare akciğerlere eksojen malzemeleri teslim noninvazif bir entübasyon yöntemi sunulmuştur.

Noninvaziv Entübasyon Fare Akciğer Patolojisi ve Fizyolojisi Eğitim için

Patojen enfeksiyonuna karşı konak bağışıklık tepkisi sıkı bir şekilde düzenlenmiş bir süreçtir. Farelerde bir lipopolisakarit akciğer maruz modeli kullanarak, bu hastalığın patojenezi ile ilgili kompleks mekanizmalar yüksek çözünürlüklü değerlendirme yapmak mümkündür.

Farelerde Host immün yanıtı değerlendirmek için Orofarengeal intratrakeal PAMP İdaresi ve Bronchoalveolar Lavage Kullanımı

Reaktiflerin Entübasyon aracılı intratrakeal (IMIT) instilasyon solunum yolu hastalıkları, hem de akciğer içine doğrudan tedavi reaktifler aşılamak için bir yöntem incelenmesi için mükemmel, invazif olmayan bir yöntemdir. Bu klinik öncesi test için uygun bir hızlı ve yüksek oranda çoğaltılabilir bir yöntemdir.

Entübasyon-aracılı intratrakeal (IMIT) damlatma: A Noninvaziv, Lung-özel Dağıtım Sistemi

Bu yazının amacı, büyük ölçüde akciğer kanseri ya da diğer patolojiler ile kurulum ve fare akciğerlerin analizine yardımcı olacak basit yöntemler tarif etmektir. Biz sadece ve güvenilir akciğer instilasyonlar, fiksasyon ve akciğer hacim ölçümleri yürütmek için 3 protokol sunuyoruz.

Fare Akciğer Kanseri Araştırma Faydalı instillation ve Fiksasyon Yöntemi

Bu makalede, entübasyon yoluyla fare trakea içine doğrudan bleomisin yönetmek için hızlı ve basit bir yöntem sunar. Bu yöntemin en önemli avantajları usta son derece tekrarlanabilir kolay ve özel ekipman ya da uzun iyileşme süreleri gerektirmez vardır.

Farelerde Trakea hızlı intübasyon için geliştirilmiş bir yöntem

Bu hassas kesim Akciğer dilimleri (PCLS) üretilmesi ve akciğerde çeşitli immün hücre tipleri lokalizasyonunu görselleştirmek için bunları immünolojik boyama için bir yöntem tarif eder. Bizim protokol, çeşitli koşullar altında konum ve birçok farklı hücre tiplerinin fonksiyonunu görselleştirmek için uzatılabilir.

Hassas kesimli Canlı Pulmoner Dendritik Hücreler Visualize&#39;a Fare Akciğer Dilimleri

Burada küçük hücreli dışı akciğer kanseri çalışma için zaman ve maliyet azaltma mankenlik minimal invaziv syngeneic orthotopic nakli manken fare akciğer adenokarsinom hücre açıklayın.

Orthotopic nakli PD-L1 ifade çalışmaya Syngeneic akciğer adenokarsinom hücre

Farelerde deneysel ajanlar intratracheal (It) yönetimi genellikle distal akciğerlere asimetrik teslim sonuçlanır.  Bu raporda, her akciğeri operatif olmayan canlı fareler içinde cannulate için doğrudan intrabronchial (ıB) yaklaşımı açıklanmaktadır.  Bu yaklaşım, bir akciğer için seçici olarak ajanlar yönetmek için kullanılabilir ya da her iki akciğerde simetrik Ajan teslim geliştirmek için adapte olabilir.

Fare akciğer Içinde seçici Ajan biriktirme geliştirmek için doğrudan Intrabronchial yönetim

Bu çalışmada, murin solunum sisteminin immün popülasyonlarını izole etmek için etkili ve tekrarlanabilir bir protokol sunuyoruz. Ayrıca, 9 renk tabanlı bir akış sitometri paneli kullanarak, sağlıklı farelerin akciğerlerinde bulunan tüm doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık hücrelerinin tanımlanması için bir yöntem sunuyoruz.

Murin Akciğerinin Doğuştan Gelen ve Adaptif İmmün Hücrelerinin Tanımlanması için Akım Sitometrik Analizi

Burada, noninvaziv orofaringeal endotrakeal entübasyon yoluyla intratrakeal lipopolisakkarit (LPS) doğumu için bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, hayvan için cerrahi prosedürün travmasını en aza indirir ve LPS'yi trakeaya ve daha sonra akciğerlere doğru bir şekilde iletir.

Farelerde Noninvaziv İntratrakeal Lipopolisakkarit Damlatma

Murin intrapulmoner trakeal transplantasyon (IPTT) modeli, akciğer transplantasyonu sonrası obliteratif hava yolu hastalığını (OAD) incelemek için değerlidir. Allotransplantasyon sonrası hava yolu obliterasyonunda akciğere özgü immünolojik ve anjiyojenik davranış hakkında yüksek tekrarlanabilirlik ile bilgi sunar. Burada, IPTT prosedürünü ve beklenen sonuçlarını açıklıyoruz.

Murin İntrapulmoner Trakeal Transplantasyon: Akciğer Transplantasyonu Sonrası Obliteratif Hava Yolu Hastalığının Araştırılmasında Bir Model

Öğrenin farelerde cerrahi olmayan intratrakeal damlatma yöntemiyle akciğer bağışıklık hücrelerini akış sitometri ile analiz etmeyi. Bu teknik, test materyallerinin akciğerlere yönlendirilmiş teslimini sağlar.

Akış Sitometri Akciğerler ve Akciğer Boşaltma lenf düğümleri Analizi fareler cerrahi olmayan intratrakeal damlatma

Daha fazla video keşfet