Name: Hücreler stellat Yedi Adımda (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Öğrenin, fare karaciğerinden hepatik stellat hücre izolasyonunu enzimatik perfüzyon ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu kullanarak. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Smith Aile Biyomedikal Araştırma ve NIH RO1 AI083426-01 (FW) Mükemmellik Ödülü tarafından finanse edildi. Patrick Maschmeyer ve Melanie Flach Boehringer Ingelheim Vakfı doktora bursları tarafından desteklenmektedir.

C57BL / 6 fareler ~ 20 hafta veya daha büyük yaş kullanılmalıdır. 25-30g ağırlığındaki erkek farelerin kullanılması tavsiye edilir. Stellat hücrelerin hücre izolasyonu stellat önce 2 ay süreyle fareler A vitamini ile zenginleştirilmiş diyet beslenme verim artırılabilir. Balb / c farelerinde stellat hücreler verimi oldukça yüksek iken, yaklaşık 2x10 5 hepatik stellat hücreler, bir C57BL / 6 fare karaciğer arınmış olabilir. Aşağıdaki protokolü 5 farelere ayarlanır. Hayvan bakım ve deney onaylanan Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu protokolleri uyarınca yapıldı. 1. fare ciğeri in situ perfüzyon sindirim enzimleri <ol><li> 37 ° C su banyosunda SC1 tampon ve enzim perfüzyon çözümleri ısıtın. </li><li> Kanatlı bir infüzyon peristaltik bir pompa silikon tüp üzerine monte edin. </li><li> PBS ile pompa karaciğer in situ perfüzyon için kullanılacak olan akış hızı 6.5ml/min, laminer akış elde etmek için kalibre edin. SC1 çözümü ile silikon tüp dengelenmesi. </li><li> Ketamin (90 mg / kg) ve Xylazine çözümü ve derin bir uyuşturma sağlamak için reflekslerin kaybı için test (10 mg / kg) intraperitoneal enjeksiyonu ile fare anestezisi. </li><li> Uygun bir kaide üzerinde yatar pozisyonda fare sabitleyin. </li><li> Karın deride uzunlamasına bir kesi yapmak ve periton maruz makas ve forseps kullanın. </li><li> Periton dikkatlice açın ve portal ven göstermek için karın boşluğunun sol tarafında hayvan bağırsaklarında dışına taşımak. </li><li> Portal ven içine infüzyon kanülü takın. Bu adım için, bir stereomikroskopta kullanılması tavsiye edilir. </li><li> 30ml SC1 çözümü ile karaciğer perfüzyon başlayın. Vena kava inferiyor akışını başlatmak hemen sonra açın. Başarılı kızarma karaciğer, karaciğer doku renk kaybı ile gösterilir. </li><li> 30ml Pronase E çözümü ile karaciğer serpmek. Başarılı sindirim üzerine, karaciğer loblar şişmeye ve lobülleri kapsül ile farklı görünecektir. </li><li> 30ml kollajenaz P çözümü ile karaciğer serpmek. Bu noktada karaciğer şeklini kaybetmiş ve atonik ve şekilsiz görünüyor. </li><li> Diyafram ve çevre organların dikkatle karaciğer ayrı ve 70ml SC2 çözüm buz üzerinde saklayın. </li><li> Ek fareler için prosedürü tekrarlayın. </li></ol> 2. Fare ciğeri in vitro sindirim Ilave bütün adımlar bir laminer akış kaputu steril koşullar altında yapılmalıdır. <ol><li> Ciğeri keskin bir makas kullanarak yaklaşık 2x2x2mm 3 parçalar halinde kesin. </li><li> Pronase E-kollajenaz P çözüm 50ml ile karaciğer parçaları dahil olmak üzere 70ml SC2 askıya birleştirin ve DNaz I çözüm 1ml eklemek. </li><li> 37 20dk için ciğeri Digest ° C karıştırma. </li></ol> 3. Yoğunluk gradient santrifüj <ol><li> 6 50ml Falcon tüpler içine 70μm hücre süzgeçler ile hücre süspansiyonu Filtre ve SC2 tampon ile 50ml kadar ekleyin. 600g ve 4 ° C de 10 dakika süreyle Santrifüj </li><li> Süpernatantı dikkatlice 40ml aspirat, daha sonra her tüpe 150μl DNaz I çözümü eklemek ve hücreleri tekrar süspansiyon. </li><li> 4 50ml Falcon tüpler içine Havuzu hücre süspansiyonları ve GBSS-B, santrifüj, 600g ve 4 10 dakika süreyle yıkayın ° C </li><li> Pelet ve her tüp eklemek 150μl DNaz I çözüm rahatsız etmeden dikkatlice aspire kadar mümkün olduğunca süpernatant. 10ml tüp başına GBSS-B hücre pelet yeniden süspanse edin. </li><li> Havuz 2 50ml Falcon tüpler içine hücre ve tüp başına 36ml toplam hacmi GBSS-B. Her bir tüp 14ml Nycodenz çözümü ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Toplam 10 tüp sonuçlanan hücre süspansiyonu, 10ml 12ml degrade santrifüj tüpü içine aktarın. 1.5ml GBSS-B için tüp yavaşça hücre süspansiyonu kaplaması. </li><li> 1500g ve 4 15dk için gradyanlar Santrifüj ° C frensiz. Daha sonra ise stellat hücreleri, beyaz bir halka olarak interfaz bulunan, hepatositler tüpün alt kısmında pelet olacaktır. </li><li> Stellat hücreler içeren interfaz dikkatlice hasat ve GBSS-B ile yıkayın; 600g ve 4 santrifüj 10dk ° C </li><li> Süpernatantı aspire ve% 10 ısı inaktive FBS,% 1 Penisilin / Streptomisin, 2mm L-Glutamine, 1mm sodyum piruvat ve 10mM Hepes ile desteklenmiş 20ml DMEM hücrelerin tekrar süspansiyon haline getirin. 2x10 4 hücre / cm 2 'lik bir konsantrasyon hücrelerin doku kültürü şişeler içine aktarın. 37 ° C ve% 5 CO 2 hücreleri inkübe edin. </li><li> Medya hepatik stellat hücreleri kısa bir süre (yaklaşık 2 saatlik hazırlıktan sonra) yapışık ölü hücreleri ve hücre artıkları yıkayın olarak değiştirin. </li><li> Ertesi gün, stellat hücres perinükleer A vitamini depolama lipid veziküller ile karakteristik yıldız şeklinde morfoloji geliştirmelidir. </li><li> Sonraki deneyler için, hepatik stellat hücreler Accutase, örneğin hafif bir enzimatik çözümlerini kullanarak kaplı olmayan plastik yüzeylere kolayca ayrılabilir </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar: Sağlanan protokolü kullanılarak hepatik stellat hücreler hazırlanmasını takiben, izole nüfusun saflık glial fibriller asidik protein yıldıza benzer şekil, perinükleer lipid damlacıkları ve anlatım (GFAP gibi bu hücre tipi üç temel özellikleri göz önüne alınarak test edilebilir .) Hücre izolasyonunu takiben hepatik stellat hücreler 2s karakteristik bir görünüm yanı sıra, in vitro kültüründe 1 ve 3 gün Temsilcisi resimler Şekil 1'de tasvir edilmektedir . Şekil 2, hepatik stellat hücreler, hücre izolasyonu takiben 3 gün süreyle kültüre GFAP için bir temsilci immünofloresan boyama gösterir. Hepatik stellat hücreler in vitro kültür sırasında miyofibroblastik hücrelerine ayırt . Bu aktive stellat hücrelerin karakteristik damgasını alfa düz kas aktin (αSMA) ifadesidir. Şekil 3 in vitro kültüründe gün 7 stellat hücreleri aktive ASMA ve miyozin IIA immünofloresan boyama gösterir . <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1 hepatik stellat hücreler karakteristik morfolojisi. Stellat hücreleri kullanarak fare ciğeri sağlanan protokol izole edildi. Görüntüleri stellat hücreler hücre izolasyonu sonra 2s (a, b) yanı sıra, günde 1 (c) ve 3 (d) in vitro kültüründe gün betimliyor . Hepatik stellat hücreler yüksek miktarda lipid veziküllerin perinükleer sitelerinde sergilerler ve in vitro kültüründe ilk gün (Büyütme 200x) sırasında kendi ayırt edici astral gibi morfoloji kazanmak . <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig2.jpg" alt="Şekil 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 2"> Şekil 2 Karaciğer stellat hücreler, özellikle karaciğer GFAP ifade . Stellat hücreler, in vitro kültüründe gün 3 izole ve immunofluorescently GFAP (kırmızı) için boyandı. Hücre çekirdekleri mavi (leke Hoechst) tasvir edilmektedir. <img src="/files/ftp_upload/2710/2710fig3.jpg" alt="Şekil 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="Şekil 3"> Şekil 3. Karaciğer stellat hücreler miyofibroblastlar farklılaşırlar. 7 gün boyunca C57BL / 6 farelerinde izole hepatik stellat hücreler kültüre edildi. Daha sonra, odasına slaytlara aktarılır ve ASMA (kırmızı ile gösterilen) ve miyozin IIA (yeşil tasvir) için boyandı. Hücre çekirdekleri Hoechst (mavi) ile zıt. <table border="1"><tbody><tr><td colspan="2"> SC1 Tampon </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> 190mg </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 900mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 10 ml 1M stok solüsyonu </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Fenol Kırmızı </td><td> 6mg/dl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 1l için doldurmak </td></tr><tr><td colspan="2"> SC2 Tampon </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 560mg </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> 1M stok solüsyonu, 10ml </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 400mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 151mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> 78mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 350mg </td></tr><tr><td> Fenol Kırmızı </td><td> 6mg/dl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 1l için doldurmak </td></tr><tr><td colspan="2"> GBSS-A Tampon </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Fenol Kırmızı </td><td> 6mg/dl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 1l için doldurmak </td></tr><tr><td colspan="2">GBSS-B Tampon </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> 225mg </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> 991mg </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 370mg </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> 30mg </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6 H 2 O </td><td> 210mg </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 7 H 2 O </td><td> 70mg </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2 H 2 O </td><td> 75mg </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 8g </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> 227mg </td></tr><tr><td> Fenol Kırmızı </td><td> 6mg/dl </td></tr><tr><td> dH 2 O </td><td> 1l için doldurmak </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E Perfüzyon Çözüm </td></tr><tr><td> Pronase D </td><td> 100mg (4000 PU / mg dak.) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Kollajenaz P Perfüzyon Çözüm </td></tr><tr><td> Kollajenaz P </td><td> 85mg (1.78 U / mg LYO) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 200ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Pronase E-kollajenaz P Çözüm </td></tr><tr><td> Pronase D </td><td> 50mg (4000 PU / mg dak.) </td></tr><tr><td> Kollajenaz P </td><td> 85mg (1.78 U / mg LYO) </td></tr><tr><td> SC2 Tampon </td><td> 50ml </td></tr><tr><td colspan="2"> DNaz I Çözümü </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> 6 mg (yaklaşık 2000U/mg) </td></tr><tr><td> GBSS-B </td><td> 3ml </td></tr><tr><td colspan="2"> Nycodenz Çözüm </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> 8g </td></tr><tr><td> GBSS-A </td><td> 28ml </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Tamponlar ve hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için gerekli enzim çözümleri. Tüm tamponları pH 7,3-7,4 ayarlanmış olmalıdır. Ayrıca, tüm tamponlar steril filtrasyon tavsiye edilir. Verilen enzimatik aktivite göre kullanılan enzim miktarı uyum önemlidir.

<ol><li>Friedman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+protean%2C+multifunctional%2C+and+enigmatic+cells+of+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: protean, multifunctional, and enigmatic cells of the liver.</a> Physiol Rev. 88, 125-172 (2008).</li>
<li>Geerts, A. H. istory <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((heterogeneity%2C+developmental+biology%2C+and+functions+of+quiescent+hepatic+stellate+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Liver+Dis%22%5BJournal%5D)">heterogeneity, developmental biology, and functions of quiescent hepatic stellate cells.</a> Semin Liver Dis. 21, 311-335 (2001).</li>
<li>Gressner, A. M. &amp, Weiskirchen, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modern+pathogenetic+concepts+of+liver+fibrosis+suggest+stellate+cells+and+TGF-beta+as+major+players+and+therapeutic+targets%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Modern pathogenetic concepts of liver fibrosis suggest stellate cells and TGF-beta as major players and therapeutic targets.</a> J Cell Mol Med. 10, 76-99 (2006).</li>
<li>Reynaert, H., Thompson, M. G., Thomas, T., Geerts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+stellate+cells%3A+role+in+microcirculation+and+pathophysiology+of+portal+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Hepatic stellate cells: role in microcirculation and pathophysiology of portal hypertension.</a> Gut. 50, 571-581 (2002).</li>
<li>Winau, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ito+cells+are+liver-resident+antigen-presenting+cells+for+activating+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Ito cells are liver-resident antigen-presenting cells for activating T cell responses.</a> Immunity. 26, 117-129 (2007).</li>
<li>Minicis, S. D. e <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profiles+during+hepatic+stellate+cell+activation+in+culture+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Gene expression profiles during hepatic stellate cell activation in culture and in vivo.</a> Gastroenterology. 132, 1937-1946 (2007).</li>
<li>Knittel, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+liver+myofibroblasts+and+hepatic+stellate+cells+in+normal+and+diseased+rat+livers%3A+distinct+roles+of+%28myo-%29fibroblast+subpopulations+in+hepatic+tissue+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Histochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Localization of liver myofibroblasts and hepatic stellate cells in normal and diseased rat livers: distinct roles of (myo-)fibroblast subpopulations in hepatic tissue repair.</a> Histochem Cell Biol. 112, 387-401 (1999).</li>
</ol>

Karaciğer stellat hücreler karaciğer temel fizyolojik ve patofizyolojik süreçleri düzenler. Ayrıca, stellat hücreler karaciğer bağışıklık yanıtının önemli bir bileşeni render, antijen sunan özelliklere sahip. Hepatik stellat hücreler karaciğer toplam hücre sayısı% 10-15 oluşturan rağmen, bu hücrelerin izolasyonu Disse perisinüzoidal uzayda lokalizasyonuna nedeniyle zordur. Burada yerinde sindirim ve sonraki gradient santrifüj fare ciğeri hepatik stellat hücreler izole etmek için bas...

<table border="1"><tbody><tr><th> Reaktif Adı </th><th> Şirket </th><th> Katalog No. </th></tr><tr><td> 70μm Hücre Süzgeç </td><td> BD </td><td> 352350 </td></tr><tr><td> CaCl 2 x 2H 2 O </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C3306 </td></tr><tr><td> Kollajenaz P </td><td> Roche </td><td> 11249002001 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Gibco </td><td> 11960 </td></tr><tr><td> DNaz I </td><td> Roche </td><td> 10104159001 </td></tr><tr><td> DPBS </td><td> Cellgro </td><td> 21-031-cv </td></tr><tr><td> EGTA </td><td> Fluka </td><td> 3777 </td></tr><tr><td> Fetal sığır serumu </td><td> Gibco </td><td> 16000 </td></tr><tr><td> Glikoz </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G7528 </td></tr><tr><td> Gradient Santrifüj Tüpleri </td><td> Greiner Bio-One </td><td> 163160 </td></tr><tr><td> Hepes </td><td> Gibco </td><td> 15630 </td></tr><tr><td> KCL </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9541 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P9791 </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> Gibco </td><td> 25030 </td></tr><tr><td> MgCl 2 x 6H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 63068 </td></tr><tr><td> MgSO 4 x 2 O 7H </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M2773 </td></tr><tr><td> Na 2 HPO 4 x 2H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71643 </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> S3014 </td></tr><tr><td> NaH 2 PO 4 x H 2 O </td><td> Fluka </td><td> 71507 </td></tr><tr><td> NaHCO 3 </td><td> Fluka </td><td> 71628 </td></tr><tr><td> Nycodenz </td><td> Accudenz AG </td><td> AN7050/BLK </td></tr><tr><td> Penisilin / Streptomisin </td><td> Gibco </td><td> 15140 </td></tr><tr><td> Peristaltik Pompa </td><td> Cole Parmer </td><td> HV-7523-70 </td></tr><tr><td> Fenol Kırmızı </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P4633 </td></tr><tr><td> Pronase D </td><td> Calbiochem </td><td> 7433-2 </td></tr><tr><td> Silikon Tüp </td><td> Masterflex </td><td> HV-96.440-14 </td></tr><tr><td> Sodyum Piruvat </td><td> Gibco </td><td> 11360 </td></tr><tr><td> Doku kültürü şişesi (25cm 2) </td><td> BD </td><td> 353108 </td></tr><tr><td> Kanatlı İnfüzyon Seti </td><td> Terumo </td><td> 1SV27EL </td></tr></tbody></table>

hücreler stellat yedi adımda

Seven Steps to Stellate Cells

Karaciğer yıldız gibi morfoloji stellat hücreleri, karaciğer yerleşik hücreleri ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ve hepatositlerde 1,2 arasında Disse bir boşluk bulunmaktadır . Stellat hücreler, kemik iliği öncüleri türetilen ve toplam vücut A vitamini 1, 2% 80 kadar mağaza vardır . Stellat hücrelerin aktivasyonu üzerine, böylece karaciğer fibrozu 3 katkıda miyofibroblastlar içine ekstraselüler matriks üretmek için ayırt. Sözleşme yeteneklerini dayanarak, miyofibroblastik stellat hücreleri, portal hipertansiyon 4 ile ilişkili vasküler tonunu ayarlayabilir . Son zamanlarda, hepatik stellat hücreler güçlü antijen sunan hücreler ve NKT hücrelerinin yanı sıra, geleneksel T lenfositleri 5 etkinleştirebilirsiniz gösterdi. Burada, fare karaciğer hepatik stellat hücrelerinin etkin bir şekilde hazırlanması için bir yöntem mevcut. Perisinüzoidal yerelleştirme nedeniyle, hepatik stellat hücreler izolasyonu çok adımlı bir süreçtir. Stellat hücreler Disse uzay izolasyon erişilebilir kılmak için, fare ciğeri, sindirim enzimleri Pronase E ve kollajenaz P. ardından perfüzyon ile in situ perfüze olan, karaciğer doku Pronase E ve kollajenaz P ile ek enzimatik muameleye tabi tutulur in vitro. Daha sonra, bu yöntem büyük miktarda A vitamini depolama hepatik stellat hücreler lipid damlacıkları yararlanır. Bu özellik,% 8 Nycodenz degrade santrifüj diğer karaciğer hücre tipleri stellat hücrelerin ayrılmasını sağlar. Burada açıklanan protokol stellat hücreler son derece saf ve homojen bir nüfus verir. Hazırlıkları Saflık floresan mikroskobu veya flow sitometri analizi öncesinde marker molekül glial fibriller asidik protein (GFAP), boyama ile tespit edilebilir. Ayrıca, ışık mikroskobu, yüksek miktarda lipid damlacıklarının limanı yıldız şeklinde hepatik stellat hücreler benzersiz bir görünüm ortaya koymaktadır. Birlikte ele alındığında, biz temsilcisi morfolojik görünüm görüntüleri ve stellat hücre varlık tanımlamak için yardımcı GFAP ifade de dahil olmak üzere hepatik stellat hücreler, verimli izolasyonu için ayrıntılı bir protokol mevcut.

Burada fare karaciğer hepatik stellat hücrelerin izolasyonu için bir yöntem açıklanmaktadır. Stellat hücre saflaştırma için, fare ciğeri sindirilir<em&gt; In situ</em&gt; Ve<em&gt; In vitro</em&gt; Yoğunluk gradiyenti santrifüj önce pronase kollajenaz tedavi. Bu teknik son derece saf hepatik stellat hücreler elde edilir.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Hepatik stellat hücreler, yıldız benzeri morfolojiye sahip karaciğer yerleşik hücreleridir ve karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri arasındaki Disse boşluğunda yer alırlar...

Bu prosedürün genel amacı, fare karaciğerinden hepatik stellat hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare karaciğerlerinin sindirim enzimleri ile iki kez perfüzyonuna tabi tutulmasıyla gerçekleştirilir. Perfüzyonun ardından, bir sonraki aşama olan in vitro sindirimin verimliliğini artırmak için karaciğerler küçük parçalara ayrılır.Son adım olarak, hepatik yıldız hücreler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile diğer karaciğer hücresi tiplerinden ayrılır. Nihayetinde hepatik yıldız hücreler elde edilir ve saflıkları ışık ve immünofloresan mikroskopisi ile değerlendirilebilir. Prosedürü bir laboratuvardan lisansüstü öğrencisi Patrick Meyer gerçekleştirecek. Fare karaciğerlerinin NC iki perfüzyonuna hazırlık olarak, önce SC bir tamponu ve enzim perfüzyon çözeltilerini 37 °C'lik bir su banyosunda ısıtın.Ardından, 6,5 mililitre/dakika hızında laminar akış elde etmek için peristaltik pompayı ayarlayın ve pompanın silikon tüpünü SC one solüsyonu ile dengeleyin. Şimdi, anestezi altındaki farenin derin sedasyonda olduğunu refleks kaybı ile doğrulayın. Ardından fareyi uygun bir taban üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.Abdominal ciltte boylamsal bir insizyon yapmak ve peritonu açığa çıkarmak için makas ve pens kullanın. Portal veni açığa çıkarmak için peritonu dikkatlice açın ve bağırsakları abdominal boşluktan hayvanın sol tarafına doğru kaydırın. Bu prosedürün en zoryla kısmı, gösterilecek olan karaciğerlerin sindirim enzimleri ile zeto perfüzyonudur.Ardından, kanül yerleştirilirken bir stereo mikroskop kullanmak ve perfüzyon sırasında karaciğer yapılarındaki değişimi yakından izlemek önemlidir. Stereo mikroskop altında çalışırken, infüzyon setinin kanülünü portal vena içerisine yerleştirin. Karaciğerin perfüzyonuna 30 mL SC one çözeltisi ile başlayın. Akışı başlattıktan hemen sonra Vena Cava inferior'u açın.Karaciğerin başarılı bir şekilde yıkanması, karaciğer dokusundaki renk kaybı ile anlaşılır; ardından karaciğeri 30 mililitre Pronase E çözeltisi ile perfüze edin. Pronase E çözeltisi ile perfüzyondan sonra karaciğer lobları şişecek ve lobüller kapsül üzerinden belirgin görünecektir; ardından 30 mililitre kollagenase P çözeltisi ile perfüzyon yapın. Kollagenase P perfüzyonu tamamlandığında, karaciğeri diyaframdan ve çevre organlardan dikkatlice ayırarak fareden çıkarın ve buz üzerinde 70 mililitre SC iki çözeltisi içinde saklayın.Bu aşamada karaciğer şeklini kaybetmiş, atonik ve amorf görünmektedir. Fare karaciğerlerinin sindirilme işlemi, steril koşullar altında, laminer akışlı bir kabinde gerçekleştirilmelidir.Karaciğerleri keskin bir makas kullanarak yaklaşık iki çarpı iki çarpı iki kübik milimetrelik parçalara bölün. Ardından, 70 mililitre SC iki süspansiyonunu ve karaciğer parçalarını 50 mililitre proteaz E kolajenaz P çözeltisi ile birleştirin. Bir mililitre dna, bir çözeltisi ekleyin ve karaciğerleri karıştırarak 37 °C'de 20 dakika boyunca sindirin.Karaciğer dokusunun enzimatik sindiriminden sonra, yıldız hücreler yoğunluk gradyanı santrifügasyonu ile diğer hepatik hücre tiplerinden ayrılır. Bu prosedüre başlamak için, hücre süspansiyonunu 70 mikrometrelik hücre süzgeçlerinden geçirerek altı adet 50 mililitrelik falcon tüpüne filtreleyin ve hücreleri E iki tamponu ile yıkayıp 600 Gs ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifügasyon sonrası, her tüpteki süpernatantın 40 mililitresini dikkatlice aspire edin.Ardından, her tüpe 150 µL DNA's, one çözeltisi ekleyin ve hücreleri yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonlarını dört adet 50 mL'lik Falcon tüpünde birleştirin ve 4 °C'de 600 ×g'de 10 dakika boyunca G-B-S-S-P santrifüjü ile yıkayın. Pelete zarar vermeden süpernatantın mümkün olduğunca fazlasını dikkatlice aspire edin ve her tüpe 150 µL DNAs one çözeltisi ekleyin.Hücre peletlerini tüp başına 10 mililitre G-B-S-S-B içinde süspanse ediyoruz. Hücreleri iki adet 50 mililitrelik falcon tüpünde topluyoruz ve tüp başına toplam hacim 36 mililitre olacak şekilde G-B-S-S-B ekliyoruz. Her bir tüpe 14 mililitre den solüsyonu ekleyip iyice karıştırıyoruz.Ardından, hücre süspansiyonundan 10 mililitreyi bir adet 12 mililitrelik gradyan santrifüg tüpüne aktararak toplamda 10 tüp elde edin. Hücre süspansiyonunun üzerine, tüp başına 1,5 mililitre G-B-S-S-B'yi nazikçe ekleyin. Gradyanları ara vermeden 1500 Gs'de ve dört santigrat derecede 15 dakika boyunca santrifüjleyin.Ardından, hepatositler tüpün dibinde çökelirken, yıldız hücreler ara yüzeyde beyaz bir halka şeklinde bulunur. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, yıldız hücreleri içeren ara yüzeyi dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri G-B-S-S-B ekleyip 600 Gs'de ve dört °C'de 10 dakika santrifüj ederek yıkayın.Süpernatantı aspire edin ve hücreleri takviyeli 20 mililitre DMEM içinde tekrar süspanse edin. Hücreleri saydıktan sonra, santimetrekare başına 2 × 10⁴ hücre konsantrasyonunda doku kültürü flasklarına aktarın ve hücreleri 37 °C ve %5 karbondioksit ortamında inkübe edin. Hazırlanmalarından yaklaşık iki saat sonra hepatik stellat hücreler adherent hale gelmelidir; ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için medyayı değiştirin.Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin; bu protokol kullanılarak fare karaciğerlerinden hepatik yıldız hücrelerinin hazırlanmasına dair temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. İn vitro kültürün birinci ve üçüncü günündeki hücreler, hepatik yıldız hücrelerinin karakteristik morfolojisini sergilemektedir. Hücreler astroglial şekillidir ve lipid vezikül depolama özelliği göstermektedir.Çekirdek bölgelerinde, izole edilen hepatik stellat hücrelerin saflığı, glial fibriler asit proteininin veya GFAP'nin ekspresyonu ile de doğrulanabilir. Bu görüntüler, hücre izolasyonunu takip eden üç günlük kültürleme sonrası hepatik stellat hücrelerde kırmızı renkte gösterilen temsili bir GFAP immünofloresan boyamasını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, saf stellat hücrelerden yeterli verim elde etmek için nöron karaciğerinden hepatik stellat hücrelerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmanız gerekir.Karaciğer perfüzyonu sonrası etkili sindirimin sağlandığından emin olmak önemlidir. Son olarak, hepatik dal hücrelerinin morfoloji ve fenotipini değerlendirerek izole edilen hücrelerin uygun kimliğinin belirlenmesi hayati önem taşır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Stromal hücre kaynaklı etkinlik inducing (SDIA) kullanarak embriyonik kök (ES) hücreleri nöroepitelyal öncüleri türetilmesi.

ES Hücre türetilen nöroepitelyal Hücre Kültürleri

Bu video, insan kaynaklı pluripotent kök hücreleri serebellar progenitörlere ayırmak için bir protokolü göstermektedir. Embriyoid cisimcikleri oluşturmak için kök hücre kolonilerinin ultra düşük bir bağlanma plakasına aktarılmasını, büyüme faktörleri ile farklılaşmanın teşvik edilmesini ve daha sonra embriyoid cisimciklerinin yapışma için matris kaplı bir plakaya aktarılmasını içerir. Sonraki adımlar, hücre göçünü indüklemeyi ve glutamaterjik ve GABAerjik serebellar nöronal öncülerin ve...

İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücrelerden 2D Tek Tabakalı Serebellar Hücreler Oluşturma Tekniği

Dev siliyer Stentor coeruleus, tek hücrelerde rejenerasyon ve yara iyileşmesini incelemek için klasik bir sistemdir. Stentor hücrelerini aynı anda düşük ve yüksek büyütmede görüntüleyerek, yaralama öncesinde, sırasında ve sonrasında sitoplazmik akışları ölçmek mümkündür.

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme Stentor coeruleus

Bu makalede, meme kanseri hücre istilasını ölçmek için üç boyutlu (3D) tahlillerin kullanımı için ayrıntılı yöntemler sağlar. Özellikle, biz hücreleri istila oluşur membran bütünlüğünün kaybı incelemek için bu tür deneyleri kurmak için gerekli prosedürleri, ölçümlerini ve veri analizi gibi yöntemleri tartışmak.

Üç boyutlu (3D) Modeli Kullanılarak Meme Kanseri Hücre invazivliğinin Kantitasyonu

İnsan adipoz kaynaklı stromal hücrelerindeki transkripsiyonel heterojenlik, hücre yüzeyi belirteçleri ve osteojenik genler kullanılarak tek hücre düzeyinde tanımlanabilir.  Bu çalışmada, kraniyofasiyal iskelet rekonstrüksiyonunu arttırmak için kullanılabilecek artmış osteojenik potansiyele sahip hücre alt popülasyonlarının izolasyonu için akış sitometrisi kullanan bir protokol tanımlanmıştır.

İzolasyon ve İnsan zenginleştirilmesi Gelişmiş Osteogenezi için Stromal Hücreleri adipoz-türevi

Insan pluripotent kök hücreler (hPSCs) farklılaştırmak ve farklı doku kalıpları içine kendini organize içsel yeteneği var; Bu mekansal çevre geçişlerini sunulmasını gerektirir rağmen. Biz hPSC farklılaşma desenleri kontrol etmek için biyokimyasal ve mekanik geçişlerini oluşturmak için basit ve sağlam bir yöntem olarak şablon micropatterning sunuyoruz.

Farklılaşma Fates Mekansal Organizasyonu Probing İnsan pluripotent kök hücrelerin Stencil micropatterning

Biz coverslips karşı antikorlar için B-hücre reseptör, ilk aşama için bir model ile kaplı üzerinde yayılmış B hücreleri aynı anda görüntü aktin yapıları, mikrotübüller ve Mikrotubul artı uç proteinler STED mikroskobu kullanılarak bir protokol mevcut bağışıklık synapse oluşumu.

Aktin ve Mikrotubul Cytoskeletons uyarılmış emisyonu tükenmesi (STED) mikroskopi kullanarak B-hücre bağışıklık sinaps, görselleştirme

Bu protokol, Caco2 kolon adenokarsinom hücrelerinden üç boyutlu küreseller üretmek ve yetiştirmek için yeni, sağlam ve tekrarlanabilir bir kültür sistemi sunar. Sonuçlar, kemoterapiye yanıt da dahil olmak üzere kanser kök hücre biyolojisini incelemek için bu yaklaşımın uygunluğu için ilk kavram kanıtını sağlar.

Kolon Kanseri Kök Hücrelerini İncelemek İçin Üç Boyutlu Bir Küresel Model

Kardiyak otonom sinir sistemindeki patofizyolojik değişiklikler, özellikle sempatik branşında, ventriküler aritmilerin başlamasına ve korunmasına katkıda bulunur. Mevcut protokolde, alttaki moleküler ve hücresel süreçlerin anlaşılmasını geliştirmek için murine stellat gangliyonunun nasıl karakterize edilir olduğunu gösteriyoruz.

Murine Stellate Ganglion'un Yeri, Diseksiyonu ve Analizi

Burada, murin kemik iliği hücrelerinin fenotip hemopoietik kök ve progenitör hücrelere izolasyonu ve boyanması ile destekleyici niş endotel ve mezenkimal kök hücrelere yönelik basit bir protokol tanımlanmıştır. Endosteal ve santral kemik iliği bölgelerinde bulunan hücreleri zenginleştirmek için bir yöntem de dahil edilmiştir.

Murin Kemik İliği Hematopoetik Kök ve Progenitör Hücrelerin ve Stromal Niş Hücrelerin Akış Sitometri Analizi

Burada, fare stria vascularis'ten birincil marjinal hücrelerin izolasyonu, saflaştırılması ve kültürü için bir protokol sunuyoruz ve koklear yan duvar bozukluklarını incelemek için oksidatif stres ve hücresel yaşlanma için in vitro modeller oluşturulmuştur.

Stria vascularis'in Primer Marjinal Hücrelerinin Yenidoğan Farelerden İzolyasyonu ve Kültürü

Öğrenin, fare karaciğerinden hepatik stellat hücre izolasyonunu enzimatik perfüzyon ve yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu kullanarak. Bu yöntem yüksek saflıkta hücre elde edilmesini sağlar.

Hücreler stellat Yedi Adımda

Daha fazla video keşfet