Hücreler stellat Yedi Adımda

Bu prosedürün genel amacı, fare karaciğerinden hepatik stellat hücreleri izole etmektir. Bu işlem, öncelikle fare karaciğerlerine sindirim enzimleri ile in situ iki perfüzyon uygulanarak gerçekleştirilir. Perfüzyonun ardından, bir sonraki adımda gerçekleştirilecek olan in vitro sindirimin verimliliğini artırmak için karaciğerler küçük parçalara ayrılır.

Son adım olarak, hepatik stellate hücreler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile diğer karaciğer hücre tiplerinden ayrılır. Nihayetinde hepatik stellate hücreler elde edilir ve saflıkları ışık ve immünofloresan mikroskobu ile değerlendirilebilir. Prosedürü, bir laboratuvardan lisansüstü öğrencisi olan Patrick Meyer gösterecek. Fare karaciğerlerinin NC 2 perfüzyonuna hazırlık için öncelikle SC 1 tamponu ve enzim perfüzyon çözeltilerini 37 °C su banyosunda ısıtın.

Ardından, 6,5 ml/dakika hızında laminar bir akış sağlamak için peristaltik pompayı ayarlayın ve pompanın silikon tüpünü SC one çözeltisi ile dengeleyin. Şimdi, anestezi altındaki farenin derin sedasyonda olduğunu refleks kaybı ile doğrulayın. Daha sonra fareyi uygun bir taban üzerinde sırtüstü pozisyonda sabitleyin.

Karın derisinde boylamsal bir insizyon yapmak ve peritonyumu açığa çıkarmak için makas ve pens kullanın. Portal veni açığa çıkarmak amacıyla peritonyumu dikkatlice açın ve bağırsakları karın boşluğundan hayvanın sol tarafına doğru çekin. Bu prosedürün en zor kısmı, gerçekleştirilecek olan karaciğerlerin sindirim enzimleri ile zeto perfüzyonudur.

Ardından, kanülü yerleştirirken bir stereo mikroskop kullanmak ve perfüzyon sırasında karaciğer yapılarındaki değişimi yakından izlemek önemlidir. Stereo mikroskop altında çalışırken, infüzyon setinin kanülünü portal vene yerleştirin. Karaciğer perfüzyonuna 30 milliliters SC one çözeltisi ile başlayın. Akışı başlattıktan hemen sonra Vena Cava inferior'u açın.

Karaciğerin başarılı bir şekilde yıkanması, karaciğer dokusundaki renk kaybı ile anlaşılır; ardından, karaciğeri 30 mililitre Pronase E çözeltisi ile perfüze edin. Pronase E çözeltisi ile perfüzyondan sonra karaciğer lobları şişecek ve lobüller kapsül üzerinden belirgin hale gelecektir; ardından 30 mililitre kollajenaz P çözeltisi ile perfüze edin. Kollajenaz P perfüzyonu tamamlandığında, karaciğeri diyaframdan ve çevre organlardan dikkatlice diseke ederek fareden çıkarın ve buz üzerinde 70 mililitre SC two çözeltisi içerisinde saklayın.

Karaciğer bu aşamada şeklini kaybetmiş olup atonik ve amorf görünür. Fare karaciğerlerinin sindirimi prosedürü, steril koşullar altında, laminer akışlı kabin içerisinde gerçekleştirilmelidir.

Karaciğerleri keskin bir makas kullanarak yaklaşık iki çarpı iki çarpı iki kübik milimetrelik parçalara bölün. Ardından, 70 mL'lik SC two süspansiyonu ile karaciğer parçalarını 50 mL proteaz E kollagenaz P çözeltisi ile birleştirin. Bir mL dna, one ekleyin ve karıştırarak karaciğerleri 37 °C'de 20 dakika boyunca sindirin.

Karaciğer dokusunun enzimatik sindiriminin ardından, stellat hücreler yoğunluk gradyanı santrifüjasyonu ile diğer hepatik hücre tiplerinden ayrıştırılır. Bu prosedüre başlamak için, hücre süspansiyonunu 70 mikrometre hücre süzgeçlerinden geçirerek altı adet 50 mililitre falcon tüpüne filtreleyin ve hücreleri E iki tamponu ile yıkayıp 4°C'de 600 G'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüjasyonun ardından, her tüpten 40 mililitre süpernatanı dikkatlice aspire edin.

Ardından, her tüpe 150 µL DNA's, one solüsyonu ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonlarını dört adet 50 mL Falcon tüpünde birleştirin ve 4 °C'de 600 ×g'de 10 dakika boyunca G-B-S-S-P santrifüjü ile yıkayın. Pelete zarar vermeden süpernatanın mümkün olduğu kadarını dikkatlice aspire edin ve her tüpe 150 µL DNAs one solüsyonu ekleyin.

Hücre peletlerini tüp başına 10 mililitre G-B-S-S-B içinde süspande ediyoruz. Hücreleri iki adet 50 mililitrelik falcon tüpünde topluyoruz ve tüp başına toplam hacim 36 mililitre olacak şekilde G-B-S-S-B ekliyoruz. Her tüpe 14 mililitre den solüsyonu ekleyip iyice karıştırıyoruz.

Ardından, hücre süspansiyonundan 10 mililitreyi bir adet 12 mililitrelik gradyan santrifüj tüpüne aktararak toplam 10 tüp elde edin. Hücre süspansiyonunun üzerine tüp başına 1,5 mililitre G-B-S-S-B yavaşça ekleyin. Gradyanları, ara vermeden 1500 Gs'de ve dört derece Celsius'ta 15 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hepatositler tüpün dibinde çökecek, stelat hücreler ise ara yüzeyde beyaz bir halka şeklinde bulunacaktır. Beş mililitrelik bir pipet kullanarak, stelat hücreleri içeren ara yüzeyi dikkatlice toplayın ve 50 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri G-B-S-S-B ekleyip 600 Gs ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüj ederek yıkayın.

Süpernatantı aspire edin ve hücreleri takviyeli 20 milliliters DMEM içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri saydıktan sonra, santimetrekare başına iki times 10 to the fourth hücre konsantrasyonunda doku kültürü flasklarına aktarın ve hücreleri 37 degrees Celsius ve %5 carbon dioxide ortamında inkübe edin. Hazırlanmalarından yaklaşık iki saat sonra, hepatik stellat hücreler adere olmalıdır; ölü hücreleri ve hücre kalıntılarını uzaklaştırmak için medyayı değiştirin.

Hücreleri inkübatöre geri yerleştirin; bu protokol kullanılarak fare karaciğerlerinden hepatik stellat hücrelerin hazırlanmasına ilişkin temsili sonuçlar burada gösterilmiştir. İn vitro kültürün birinci ve üçüncü günündeki hücreler, hepatik stellat hücrelerin karakteristik morfolojisini sergilemektedir. Bu hücreler astroglial şekillidir ve lipid vezikülleri depoladıkları görülmektedir.

Çekirdek bölgelerinde, izole edilen hepatik stelat hücrelerin saflığı, glial fibriler asidik protein veya GFAP ekspresyonu ile de doğrulanabilir. Bu görüntüler, hücre izolasyonunu takiben üç gün boyunca kültüre edilen hepatik stelat hücrelerde kırmızı renkle gösterilen GFAP için temsili bir immunofloresan boyamayı göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, saf stelat hücrelerden yeterli verim elde etmek amacıyla nöron karaciğerinden hepatik stelat hücrelerin nasıl izole edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Karaciğer perfüzyonu sonrası etkili bir sindirim sağlandığından emin olmak önemlidir. Son olarak, hepatik dal hücrelerinin morfoloji ve fenotipini değerlendirerek izole edilen hücrelerin uygun kimliğini belirlemek hayati önem taşır.